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集胞藻PCC6803::Ω-PpetE-petH的构建及其强化辅酶NADPH再生的研究

邓新星  
【摘要】:辅酶NADPH对胞内的氧化还原反应以及其他还原性物质的生产发挥着关键作用。光合作用再生辅酶NADPH的过程中,铁氧还蛋白-NADP~+还原酶(FNR)是其关键酶。通过强化FNR表达,促进其催化辅酶再生效率,对胞内还原反应及工业生物技术有重要的理论意义和参考价值。本文首先构建了过量表达FNR的工程蓝藻集胞藻PCC6803::Ω-PpetE-petH,并进一步研究FNR过量表达促进辅酶NADPH再生的效率,以及利用集胞藻PCC6803::Ω-PpetE-petH促进NADPH再生在蓝藻催化前手性羰基化合物不对称还原合成手性醇中的应用。首先,从集胞藻PCC6803中克隆出编码FNR的基因petH,利用限制性内切酶和同源重组酶将petH插入含有启动子PpetE和终止子Ω的质粒pHB1524上,构建出重组质粒pHB1524-petH。再以pHB1524-petH为模板,通过PCR扩增得到Ω-PpetE-petH片段,利用同源重组酶将Ω-PpetE-petH插入集胞藻PCC6803的通用整合平台pKW1188质粒上,构建出重组质粒pKW-Ω-PpetEpetH。利用EcoR?酶切及基因测序,鉴定得到含启动子PpetE、终止子Ω和petH基因的重组质粒p KW-Ω-PpetE-petH。通过同源重组技术把调控FNR表达的目的基因片段整合到集胞藻染色体中构建工程蓝藻。通过自然转化法将重组质粒p KW-Ω-PpetE-petH转化进集胞藻PCC6803,利用重组质粒上携带的集胞藻PCC6803 slr0168基因的同源序列,将Ω-PpetE-petH片段通过同源重组整合到集胞藻slr0168基因内,构建了过量表达FNR的工程蓝藻:集胞藻PCC6803::Ω-PpetE-petH。观察到Ω-Ppet E-petH片段的插入对集胞藻PCC6803生长没有影响。提取集胞藻的总膜蛋白,利用SDSPAGE检测到集胞藻PCC6803::Ω-PpetE-petH中的FNR蛋白表达量得到了提高,进一步证明成功构建了铜离子诱导FNR过量表达的集胞藻PCC6803::Ω-PpetEpetH。研究过量表达FNR的集胞藻PCC6803::Ω-PpetE-petH促进辅酶NADPH的再生效率,以及其在催化前手性羰基化合物不对称还原合成手性醇中的应用。结果表明,在铜离子浓度为320 nmol/L时,与野生型集胞藻PCC6803比较,集胞藻PCC6803::Ω-PpetE-petH胞内FNR酶活提高了40.74%,胞内辅酶NADPH含量提高了80.75%;利用集胞藻PCC6803::Ω-PpetE-petH催化苯乙酮不对称还原生成S-苯基乙醇,反应产率与集胞藻PCC6803比较提高了61.2%,反应时间缩短了两天;催化乙酰乙酸乙酯还原生成3-羟基丁酸乙酯,反应产率与集胞藻PCC6803比较提高了36.36%。这表明FNR的过量表达可促进辅酶NADPH再生,并提高了不对称还原催化效率。本文通过同源重组技术构建了过量表达FNR的工程蓝藻,相比于常规的载体表达目的基因,能够达到长期稳定的表达效果。本研究为促进辅酶NADPH再生代谢提供了理论与技术基础,为今后深入研究全细胞催化辅酶再生体系提供了方向。


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