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CGMMV CP蛋白特征分析及其与病毒蛋白和寄主因子互作的研究

范小燕  
【摘要】:黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是一种重要的植物病毒,分类上属于烟草花叶病毒属重要成员,危害多种寄主作物,近年来该病毒在我国多地陆续出现发生危害报道,给西瓜、黄瓜等葫芦科作物生产造成了惨重的损失,成为当前限制产业发展的重要制约因子。在烟草花叶病毒属病毒的研究中,很多研究结果显示病毒编码的外壳蛋白(Coat protein,CP)在病毒组装、侵染及致病等过程起着重要的作用,但目前在CGMMV上相关的研究报道还相对较少,CGMMV在分类上虽然属于烟草花叶病毒属成员,但与烟草花叶病毒属典型代表成员TMV等病毒的同源性相对较低,且在危害寄主上也有差别,为了深入解析CGMMV编码的CP功能特征,本论文选择2012年采自江苏的CGMMV分离物为研究对象,针对其编码的CP特征及其与相关病毒编码因子及寄主因子的互作进行了研究,为进一步阐明CGMMV编码的CP的功能特征及其在CGMMV侵染及致病过程中的作用机理奠定了基础。为了研究CGMMV编码的CP蛋白特征,本论文首先提取了感染CGMMV的病样总RNA,并以此为模板经RT-PCR克隆了黄瓜绿斑驳花叶病毒的CP基因的全序列,发现其全长486 bp,编码一个分子量17.5 kDa的蛋白,将其与已公布的CGMMV序列比对分析发现本研究获得的CP蛋白序列与其他分离物的序列基本一致,仅与部分分离物之间存在点突变,这一方面暗示了CP蛋白是一个相对保守的蛋白(特别是在国内分离物之间),另一方面说明本研究选择江苏分离物进行研究也有较好的代表性。鉴于病毒编码的蛋白功能与其亚细胞定位特征密切相关,我们将克隆的CP基因构建到35S:YFP载体上,从而获得带有YFP荧光标签的重组表达载体CP-YFP,转化农杆菌后浸润接种本氏烟(Nicotiana benthamiana),40 hpi后激光共聚焦显微镜观察,结果显示农杆菌浸润处理后本氏烟叶片表皮细胞的细胞质及细胞核都有较强的绿色荧光信号,说明CGMMV编码的CP蛋白在细胞质及细胞核均有分布。由于烟草花叶病毒属病毒的复制、转录、组装等一系列重要的生命活动大都是在细胞质内完成的,因此CP的细胞质定位特征与这些功能研究结果相吻合。在本研究确定的CGMMV编码的CP在细胞质中有分布,暗示了CGMMV编码的CP在细胞质中可能参与了这些功能的行使。在植物病毒与寄主植物的互作过程中,病毒要成功侵染寄主植物需要病毒编码蛋白参与侵染过程中的多个环节,因此很多研究结果显示病毒编码的蛋白往往具有多种功能,而病毒编码蛋白往往通过多种方式来实现这些功能,其中蛋白之间的协作就是其中的一种。在烟草花叶病毒属成员中,CP也是一种具有多种功能的蛋白。为了解析CGMMV编码的CP可能的作用方式,我们分别克隆了CP及MP基因并将其构建到酵母双杂交载体上,利用酵母双杂交技术研究了CP与CP及CP与MP之间的互作关系,结果发现共转化pGAD-CP和pGBK-CP、pGAD-CP和pGBK-MP、pGBK-CP和pGAD-MP的酵母菌株在四缺板上均不能正常生长,说明CGMMV编码的CP自身不存在互作,同时与MP之间也不存在互作。在病毒与寄主植物互作的过程中,病毒编码蛋白除了自身具有功能外,往往还会通过与寄主因子互作调控寄主的各种防卫相关反应要协助病毒完成侵染致病等过程。为了进一步解析与CP蛋白互作的寄主相关因子,我们以CP为诱饵利用酵母双杂交技术筛选了黄瓜cDNA文库,累计获得28个候选因子,序列测定后利用BLAST对获得22条核苷酸序列编码的蛋白成功进行注释(4条未获得注释信息),结果发现他们编码DnaJ、NAD、GAPD、XET等9种黄瓜蛋白,这也是关于CGMMV编码的CP蛋白互作寄主因子的首次报道;验证所得寄主因子与CP间的互作关系,解析CP蛋白功能。主要结果如下:对获得的寄主因子进行了分析后我们选择了黄瓜内切木葡萄糖转糖基酶(csXET)基因进行进一步研究,由于筛库时获得候选因子中csXET基因只含有部分片段,因此我们首先提取了黄瓜RNA并对csXET的全基因序列进行了克隆,结果显示csXET基因全长897 bp,编码一个33.4kDa的蛋白,该蛋白含有一个GH16-XET保守域,聚类分析发现其与黄瓜XET同源性最高,其次是西瓜。将克隆到的csXET基因全长构建到酵母双杂交载体后利用酵母双杂交技术验证了其与CP之间互作,结果发现其与CP存在互作,由于XET参与了植物木质纤维素降解过程,对植物细胞壁的延展性有影响,因此推测CP与其互作可能与CGMMV侵染寄主植物时导致的矮化等症状相关。
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