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在马铃薯中融合表达GLO-CAT构建光呼吸支路的研究

饶泽来  
【摘要】:光呼吸(Photorespiration)又称为C2循环,是指植物绿色组织利用光能,吸收O_2并放出CO_2的过程。在作物中通过建立光呼吸支路来降低光呼吸提高光合作用效率,是提高产量的有效途径。马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界第三大粮食作物,具有营养繁殖特性以及收获块茎的特点,所以马铃薯的光呼吸改造具有独特的优势。建立光呼吸代谢支路的第一步是分流乙醇酸,本研究为了在马铃薯转基因植物中更好的协调表达乙醇酸氧化酶(Glycolate oxidase,简称GLO)和过氧化氢酶(Catalase,简称CAT),将它们在马铃薯叶绿体中融合表达。以GLO-CAT转基因株系作为实验材料,通过分析其形态指标、生理指标及解剖结构来确定代谢支路的构建效果及稳定性。主要研究结果如下:(1)GLO-CAT融合蛋白的表达使马铃薯产生两种表型采用马铃薯多基因转化载体p BIA13作为受体,包含烟草花叶病毒35S启动子驱动的GLO和CAT融合蛋白的表达盒的p D1-St TP-58AA-CATGLO(实验室前期构建)作为供体,通过Cre-Lox P重组将GLO和CAT融合蛋白的表达盒接入到p BIA13,并将重组后的质粒p BI-St TP-58AA-CATGLO导入LBA4404。利用“鄂马铃薯3号”组培苗诱导获得试管薯进行遗传转化,筛选和分子鉴定获得转基因株系B11、B14、B17、B27。通过对两代转基因株系生长性状的观察和统计发现,相对于野生型,正常表型株系B11、B14的株高、叶面积、有效叶数和单株薯重增加;异常表型株系B27、B17叶片块茎畸形,叶面积、有效叶数、株高等降低,然而也出现了叶色更绿、更厚、更脆等积极表型。(2)转基因株系光合效率的变化光合测定结果表明,株系B14的净光合速率相对于野生型显著提高,光饱和点和最大净光合速率也明显提高。说明株系B14中融合蛋白的表达成功分流了马铃薯部分光呼吸流量,提高了叶绿体内CO_2的浓度,起到了类似C4植物的CO_2浓缩机制效果。株系B11、与出现畸形的B27、B17的光饱和点和最大净光合速率相对于野生型明显提高,但由于有效光合面积、株高等其他限制因子,它们的净光合速率未见明显的改善。因此,本研究认为融合蛋白的表达在B11、B27、B17中也发挥着积极的作用。(3)转基因株系叶片的解剖结构变化通过对叶片解剖结构的观测发现,异常表型株系B27、B17的叶片变厚变绿,表现为叶肉细胞变大,叶肉细胞更加质密,栅栏组织、海绵组织、表皮的厚度均显著增加,这有利于转基因植株保水抗旱,提高光合速率。其中叶肉细胞变大的表型与前人研究的支路亚麻荠、支路水稻一致;而株系B11、B14的叶片变薄、叶肉细胞变小、栅海比下降,其中B14栅栏组织厚度相对于野生型显著下降28%。光呼吸代谢改造造成叶片变薄的现象也在支路拟南芥中出现。(4)分流乙醇酸产生的H_2O_2造成了两种转基因表型酶活性测定结果显示,所有转基因株系的融合蛋白的GLO和CAT酶活性均得到了有效表达。进一步通过DAB对转基因株系叶片的H_2O_2染色表明,异常表型株系B27、B17的叶片中H_2O_2含量最高,正常表型株系B11、B14其次,野生型含量最低。因此本研究推测异常表型株系B27、B17中的CAT无法充分或及时清除光呼吸支路中GLO分解乙醇酸产生的大量H_2O_2,H_2O_2积累导致叶片块茎畸形并降低了株高、叶面积、有效叶数等生物量;而B11、B14是一个融合蛋白表达量适中的结果,光呼吸支路中产生的少量H_2O_2能够被CAT迅速分解。这两种表型的出现,说明马铃薯光呼吸支路的的构建,会产生积极的表型响应,但随着融合蛋白表达量的差异,对其他的代谢通路产生了负面的影响,造成了畸形的表型。因此,GLO和CAT的表达量的适中和二者酶活性表达量的协调,是光呼吸代谢支路构建的关键点。


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