粘质沙雷氏菌ZSG产灵菌红素的菌种诱变及在5L发酵罐中培养工艺优化

【摘要】：灵菌红素(Prodigiosin,PG),也称灵杆菌素或灵菌素,是一种很有开发潜力的抗癌药物。灵菌红素的合成方法主要有化学合成法和微生物发酵法。本论文采用复合菌种诱变的方法,研究了硫酸二乙酯-紫外线复合诱变的适宜诱变条件来选育高产灵菌红素菌株,通过单因素试验与正交试验对发酵培养基进行优化,确定了灵菌红素高产菌株发酵培养基最佳配方,通过在5 L发酵罐中对培养工艺进行优化确定了最佳发酵条件,为以后灵菌红素工业化生产提供参考。研究内容及结果如下:以本实验室筛选获得的粘质沙雷氏菌ZSG为出发菌株,通过硫酸二乙酯-紫外线复合诱变,并依据灵菌红素产量筛选突变菌株。结果为,用硫酸二乙酯(体积分数为1.0%)处理20 min,紫外线照射20 s的复合诱变试验,获得一株灵菌红素产量高的突变株ZSG7。对突变株ZSG7和原始菌株进行摇瓶发酵比较,ZSG7的灵菌红素产量为0.104 g/L,是原始菌株的灵菌红素产量0.064 g/L的1.63倍;对突变株ZSG7和原始菌株进行5 L发酵罐发酵比较,ZSG7的灵菌红素产量为0.1723 g/L,是原始菌株的灵菌红素产量0.0467 g/L的3.69倍;对突变株ZSG7进行5次传代稳定性试验,灵菌红素产量集中在0.102~0.109 g/L之间,表明突变株ZSG7有较好的遗传稳定性。以突变菌株ZSG7为生产菌株,选择单因子实验、正交实验对发酵培养基成分(氮源、碳源、无机盐和表面活性剂)进行优化。确定的发酵培养基最佳配方为:油酸1.0%,蛋白胨1.5%,无水氯化钾0.25%,吐温80 1.0%,NaCl 0.5%。使用最优培养基在250 mL摇瓶中发酵,灵菌红素产量比未优化前提高一倍,达到0.2079g/L。本文还对粘质沙雷氏菌ZSG7在5 L发酵罐中发酵工艺条件如温度、恒定pH值、溶氧偶联转速、补料过程进行了优化。结果为:5 L发酵罐中装液量为3 L,发酵周期为78 h,培养温度为29℃,初始搅拌转速200 r/min,溶氧值用溶氧探头实时监控,由发酵系统软件将溶氧偶联转速,通过自动调节转速控制发酵溶氧在第0~12 h稳定在10%,在第12~24 h稳定在30%,在第24 h以后稳定在60%,在发酵过程中,适当调节通气量,保证转速处于200~500 r/min之间,pH探头全程监测pH值,并由发酵主机将发酵菌液pH不变为7。补料组分为蛋白胨0.5%(w/v)、油酸0.5%(w/v)和吐温-80 0.5%(w/v),使用发酵系统自带的蠕动泵蠕动流加,起始时间点为发酵第42 h,蠕动时间为12小时。通过培养工艺优化,菌体干重有了大幅度提高,未补料前最大菌体干重为1.49 g/L,补料后最大菌体干重为2.19 g/L,分别是优化前ZSG7在5 L发酵罐的菌体干重1.07 g/L的1.39倍和2.05倍。灵菌红素产量有了大幅度提高,未补料前灵菌红素产量达到0.3822 g/L,补料后则达到0.5643g/L,分别是优化前ZSG7在5 L发酵罐产量0.2149 g/L的1.78倍和2.63倍。分别以Logistic方程和Luedeking-Piret方程为基础,对分批发酵和补料分批发酵的菌体生长和和灵菌红素合成过程建立了模型。采用Origin 8.0软件拟合出模型参数后,模型可以合理地描述分批发酵和补料分批发酵的过程。