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基于金纳米颗粒标记的ICP-MS病原细菌检测方法及应用研究

王秀季  
【摘要】:病原细菌是病原微生物的一种,存在于食品、水和环境中的病原细菌能够引起多种疾病的爆发。准确、快速的检测病原细菌对控制疾病爆发、预防疾病的流行具有重要的意义。有关病原细菌的检测方法主要包括微生物培养法、抗原抗体免疫法、分子生物学方法及生物传感器的方法。在这些方法中,微生物培养法是临床检验的“金标准”,但是整个检测过程较为繁琐,所需要的检测时间也较长,对突发事件中的样品检测无法及时获得分析结果。免疫学的方法以抗原抗体反应为基础,通过免疫反应识别靶分子进行检测,其优点是灵敏度高、检测速度快。但在实际应用中获得相应抗体的过程需要较长时间,且其特异性易受抗体来源的影响。分子生物学的方法以核酸分析为基础,通过体外合成探针对病原细菌体内的特异性DNA或者RAN进行识别和检测,其中以放大反应为基础的聚合酶链式反应技术(PCR),具有高灵敏性、准确性的特点,对核酸的检测能达到痕级,针对低含病原细菌的检测具有重要意义。但其所需放大引物的设计过程复杂,检测过程繁琐,对人员的技术要求也较高。基于各类生物传感器的方法,特别是近年来发展起来的核酸适配体技术在病原细菌的检测中越来越受到重视。电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)技术被认为是迄今为止的最好的痕元素分析手段,能够对多个元素实现同时检测,并能够获得周期表中绝大多数元素高灵敏度的检测信号以及低的检出限。除了对各类生物样品中无机元素的直接检测,基于元素标记的ICP-MS技术在蛋白质、肽、核酸、细胞乃至细菌等各种生物分子分析技术得到了一定程度的发展。这些研究通过化学反应将元素标记于抗体或者寡核苷酸及核酸适配体探针等,并能够通过生物分子之间的特异性结合(如免疫反应、杂交反应以及核酸适配体对生物分子的特异性绑定)来识别靶分子并形成反应复合物。附着在微孔板或者磁珠等固相载体表面的反应复合物酸溶解,引入ICP-MS检测标记金属元素信号强度。用于标记的金属元素主要包括镧系元素和金属纳米颗粒。镧系元素因其物理化学性质相近,可使用相同的方法进行标记,这类标记方法的优势在于可以实现对多种生物分子的同时检测。纳米颗粒标记技术与其它金属元素标记技术相比,因一个纳米颗粒含有多个原子,可以获得较低的靶分子检出限。在此领域,也出现了多种纳米颗粒同时标记检测多种生物靶分子的研究。本论文在前人已有的研究基础之上,旨在利用金纳米颗粒标记合成的生物探针,建立ICP-MS检测病原细菌的方法,并将方法用于实际应用研究。本论文主要分为以下几部分:1.为考察生物试剂在生物反应中的反应活性,实验探讨了所涉及的生物试剂以及样品的预处理和保存条件,针对反应体系中使用链霉亲和素包被作为固相载体的微孔板,为小反应体系中的非特异性吸附,采用牛血清白蛋白对微孔板进行封闭并优化。实验结果表明,37℃下的封闭时间为2小时,且牛血清白蛋白溶液浓度为5%可获得最佳检测信号。对比试验了两种不同的溶液介质(HNO3和HCl)对分析信号的影响,结果表明,5%的硝酸介质可获得更高的信号背景比值。2.建立了基于纳米金标记寡核苷酸探针以及杂交反应为基础的ICP-MS检测福氏志贺氏菌特异性DNA片段的测定方法。实验以链霉亲和素包被微孔板为固相载体,将与纳米金标记探针和生物素捕获探针通过碱基互补配对原则形成的靶分子杂交复合产物锚定在微孔板,过多次洗涤去除多余反应试剂后5%HNO3溶解测定。实验优化了杂交条件(纳米金标记探针用、捕获探针用),建立了对体外合成的能够表达福氏志贺氏菌的特异性DNA单链和模拟DNA双链的标准工作曲线,对单链DNA的检出限可达0.39 pM(LOD,3σ),检测精密度为5.8%(RSD)。双链DNA的检出限为39.17(LOD,3σ),检测精密度为5.5%(RSD)。利用合成的错链DNA分子对方法的特异性进行了考察,结果表明,方法对靶分子具有很好的识别能力。3.利用体外指数富集配基系统进化技术(SELEX)获得的适配体可以与靶分子特异性绑定的特性,建立了基于双适配体探针识别和ICP-MS检测的金黄色葡萄球菌的方法。捕获适配体探针通过生物素-链霉亲和素固定于酶标板,当一定浓度的金黄色葡萄球菌存在于检测溶液中,基于两种适配体分子对金黄色葡萄球菌的识别作用,在微孔板表面形成了“适配体-金黄色葡萄球菌-纳米金标记适配体”的“三明治”复合结构。这个复合结构的最终检测信号197Au由ICP-MS获得。为了获得最大信号背景比值,实验中优化了两种适配体探针浓度。被锚定于微孔板的捕获适配体探针的少,检测靶分子的线性范围变小。同时,捕获适配体探针的二级结构具有的空间位阻水平会限制其余靶分子的结合。在条件优化后,实验对过平板计数后的金黄色葡萄球菌纯菌株做了检测,在7×103~7×107 CFU/m L的动态线性范围建立了ICP-MS直接检测金黄色葡萄球菌的方法曲线,对金黄色葡萄球菌的检出限可以达到279 CFU/mL(LOD,3σ)。利用建立的方法检测福氏志贺氏菌纯菌株。结果表明,该方法对金黄色葡萄球菌具有特异性。同时,将建立的方法用于自来水模拟样品的检测,获得了较好的结果。4.牛奶在产奶、收集、重加工、运输及存放过程中容易受到病原细菌的感染,将从超市购买的不同批次的牛奶样品暴露于空气中不同时间,利用基于双适配体探针的ICP-MS方法检测其中的金黄色葡萄球菌的含。同时实验中还利用实时荧光PCR(Real-Time PCR)法对相同样品中的金黄色葡萄球菌进行了检测,获得了与ICP-MS方法较为一致的结果。对于未暴露于空气的牛奶样品,两种方法都未能检出金黄色葡萄球菌。对暴露于空气中不同时间的样品,暴露于空气中的时间越长,金黄色葡萄球菌的检出也越多。通过对加入标准菌株的灭菌牛奶样品的检测获得了两种方法的回收率实验结果,结果表明,Real-Time PCR和ICP-MS方法具有较好的一致性,元素标记双适配体探针ICP-MS方法可用于牛奶样品中金黄色葡萄球菌的检测。


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