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环境微生物与环境污染物的相互作用机制及环境行为

王飞  
【摘要】: 虽然环境污染物对环境健康的影响已非常重视,但是污染物对环境的影响至今仍然是一个难以解决的问题,环境污染物既包括了传统的重金属、农药和其它的有机有害物,也包括了新型的污染物(比如碳纳米材料)。这些污染物进入环境,势必会对环境微生物产生不利的影响。污染物之间也会因不同的物理化学性质而相互作用,从而改变其环境行为(比如,碳纳米材料具有较强的吸附能力,能够吸附有机污染物,从而改变两者的环境行为)。由于环境微生物能够快速的对环境的变化做出反应,从而环境微生物的活性被国际公认为评价环境健康的一个重要的指标。对测定环境微生物活性,微量量热技术具有很大的优势,能实时、原位、不间断的测定污染物与环境微生物的作用过程,并且具有高灵敏度,能监测到微生物代谢过程的细微变化。 基于以上的研究背景,本学位论文从微生物代谢活性角度并结合微生物方法联合揭示了环境污染物与环境微生物作用机制及了解了碳纳米材料与有机污染物的作用机制。具体如下: 选择了重金属(As, Cu, Cd, Cr, Co, Pb和Zn)和农药毒死蜱(Chlorpyrifos (CPF))和其环境氧化降解产物(Chlorpyrifos-oxon (CPO))对土壤微生物群落活性的毒性研究。为了刺激土壤微生物的生长,从而使分析结果更加明显,将5mg葡萄糖(碳源)和5mg的硫酸铵(氮源)加入到1g土壤中。微生物群落活性通过热功率-时间曲线来得到表征,通过该产热曲线,可以计算得到热动力学参数,微生物生长速率常数k、总放热量QT、代谢焓ΔHmet等。对于所选重金属,通过比较这些参数,可以得到所用重金属对土壤微生物活性毒性的顺序为CrPbAsCoZnCdCu。当土壤中加入重金属之后,可培养的细菌和真菌数量随着暴露时间的延长而减少,尤其是细菌数据的变化尤为明显,这也表明真菌具有更强的耐受性,细菌和真菌的比例也会随着金属压力而产生变化。对于CPF和CPO,k与biomass C和ΔHmet与biomass C都具有良好的线性关系,表明k和ΔHmet是依赖于环境微生物生长的。在此研究中,得到了两种物质的20%抑制率浓度,分别为CPF:9.8μg g-1和CPO:0.37μg-1,这也意味着CPO的毒性是其母体CPF毒性的大约26倍。由于CPO具有活性官能团,从而CPO具有更强的毒性,能够对生物体产生更大的毒害。通过比较ΔHmet和其它参数,可以看出这些参数的数据在CPF的浓度低于5.0μg-1的时候基本保持一致。其原因可能由于环境微生物在面对环境压力的时候,在某种程度上,能够将生命代谢活动消耗的能源(比如繁殖或者生物体的生长)转移为生存所需要的能量。脲酶活性测试结果与微量量热仪所测结果具有很好的一致性,即CPO对脲酶活性的影响要大于CPF对脲酶活性的影响。 在上述研究中,我们使用了热动力学参数ΔHmet,而该值的大小决定于所加入土壤样品中葡萄糖的最终消耗量,为此我们研制了用于测定葡萄糖含量的生物传感器技术,利用该生物传感器技术测定了土壤加入重金属后葡萄糖的降解情况。传感器由葡萄糖氧化酶和O-(2-羟基)丙基-3-三甲基氯化氨丁聚醣纳米颗粒(glucose oxidase/O-(2-hydroxyl) propy-3-trimethyl ammonium chitosan chloride nanoparticle (O-HTCC NP))组成并固定在洋葱内膜上。测定原理利用了加入葡萄糖后水溶液中溶解氧含量会降低,溶解氧降低的程度能够被检测到,并且与滴加的葡萄糖量(0-0.6mM)具有很好的线性相关性,其检测线为50μM (S/N=3)。深入研究了O-HTCC NP、葡萄糖酶负载、pH、温度和磷酸盐缓冲液浓度对传感器灵敏度的影响。该传感器展示了快速的反应时间(70s)、好的重现性(3.2%,n=10)和保存稳定性(保存3周后灵敏度是初始灵敏度的90%)。对于传感器来说,常见的干扰物质,包括乙酸、乳酸、丙酸、丁酸、叶酸、甲醇、甘氨酸、DL-α-丙氨酸和DL-半胱氨酸没有产生明显的影响。建立的传感器方法也成功的测定了实际样品中(橙汁、红酒和茶饮料)的葡萄糖含量,该结果与光谱方法测定的结果具有很好的相似性。葡萄糖回收率的测试中表明建立的检测方法能够提供优良的、准确的和精密的方法用于测定实际样品中的葡萄糖含量。 铁元素是绝大部分微生物必须的一种营养元素,而在过量时也会产生毒害。此外,铁也是环境中普遍存在的,为此,我们系统的研究了不同形态铁与不同单一环境微生物的相互作用,铁作用下细菌-真菌的相互作用效应及Fe2+降低As3+毒性的效果。微量热技术研究了Fe(Ⅲ)-EDTA对接种到灭菌土壤中的Pseudomonas putida(细菌),Candida humicola(真菌)及两者的混合菌的毒理效应。微量热参数随着Fe的剂量的增加而随着降低,并可以用方程Y=A×exp(-x/t)+y0能够模拟参数的变化趋势。比较单一及混合微生物,在较低的浓度作用下,细菌-真菌的相互作用为主导,然而随着浓度的增加,铁的毒性就成为主要的影响因素,降低微生物代谢活性。在铁作用下,相比较单一微生物来说,混合微生物具有中等的耐受性,并且在较低浓度下(0-0.3 mg g-1),微生物的指数生长阶段上表现出协同作用。 利用了微量热技术评价不同形态铁(Fe2+(FeCl2),Fe3+(FeCl3)和Fe3+(FeC6H507))对大肠杆菌的毒理效应。随着铁浓度的增加,细菌生长阶段的延迟期逐渐延迟,热功率则逐渐减低。这表明随着铁浓度的增加,Escherichia coli受到不同程度的抑制。通过比较细菌的生长速率常数,k,可以知道在较低的浓度能够促进Escherichia coli的生长(即k随着铁浓度增加而变大)Fe2+(FeCl2),2-10 pg mL-1(k,0.02862→0.03055 min-1);Fe3+(FeCl3),2-10μgmL-1(k,0.02890→0.03056 min-1);Fe3+(FeC6H507),2-4μg mL-1(k,0.02213→0.02607min-1);高浓度就会抑制细菌的生长(即k随着铁浓度增加而变小),Fe2+(FeCl2),10-80μg/mL(k,0.03055→0 min-1);Fe3+(FeCl3),10-80μg/mL (k,0.03056→0 min-1);Fe3+(FeC6H5O7),4-20μg/mL(k,0.02607→0 min-1)。总放热量(Qtotal)与铁的浓度具有很好的线性变化关系。最后,通过比较半抑制率浓度(IC50),可以得到不同形态铁对Escherichia coli生长的毒性大小顺序,Fe3+(ferric citrate)(9.45μgmL-1)Fe2+(ferrous chloride)(45.23μg mL-1)Fe3+(ferric chloride)(47.12μg mL-1)。螯合铁具有最强的毒性,由于更容易进入细胞体内。 在自然环境中,存在一些螯合剂,即含铁细胞,它们对于Fe3+具有很强的亲和性,而对Fe2+具有较低的亲和性。因此,研究了硫酸铁氨(AFS)对Bacillus subtilis, Pseudomonas putida和Candida humicola的毒性。当铁的浓度达到320.0,160.0 and 160.0μg mL-1,Candida humicola, Bacillus subtilis和Pseudomonas putida的生长被完全抑制。对于三种微生物来说,在一定范围内,生长速率常数(k)与铁的浓度保持较好的线性关系,即Pseudomonasputida,10.0-160.0μg mL-1(R=-0.9746); Bacillus subtilis,0-160.0μg mL-1(R=-0.9868);Candida humicola,10.0-320.0μg mL-1(R=-0.9955)。在较低的浓度范围内,总放热量(QT)几乎保持一定的数值,即Pseudomonas putida和Bacillus Subtilis(≤20.0μgmL-1)的QT分别为0.56±0.01 and 0.26±0.01 J mL-1,Candida humicola(≤40.0μgmL-1)的QT值为0.58±0.03 J mL-1。通过比较三种微生物对铁的半抑制率浓度(IC50),对三价铁的耐受性为Candida humicola(90.1μgmL-1)Bacillus Subtilis(65.94 pg mL-1)Pseudomonas putida(58.79μg mL-1)。在没有铁作用下,测定了微生物生长的生物量和光密度(OD600),结果与微量热方法的得到了微生物的生长情况保持一致,这说明微量热方法所得结果是可以与微生物学方法所得数据进行比较的。 在厌氧环境中,尤其对于在地下水系统中,As(Ⅲ), Fe(Ⅱ)和磷酸盐(phosphate)可以共同存在的。为了评价这些这些离子之间的相互作用及Fe(Ⅱ)对于降低As(Ⅲ)毒性的程度,我们利用Pseudomonas fluorescens在不同离子作用下的代谢热的变化来表征。相比对照组、单独As(Ⅲ), Fe(IⅠ)和P,三种离子混合作用下的放热效应介于中间,即热功率(Pmax),参照(328.4±21.5uW),As(Ⅲ)+Fe(Ⅱ)+P (291.6±17.5μW), Fe(Ⅱ) (253.5±20.3μW)和As(Ⅲ)(208.3±14.9μW);生长速率常数(k2),参照((6.3±0.4)×10-3 min-1),As(Ⅲ)+Fe(Ⅱ)+P((5.4±0.3)×10-3 mmin-1),Fe(Ⅱ)((4.8±0.4)×10-3 min-1)和As(Ⅲ)((3.9±0.2)×10-3 mmin-1);总放热量(QT),参照(8.7±0.4J), As(Ⅲ)+Fe(Ⅱ)+P (7.8±0.6J), Fe(Ⅱ) (7.0±0.4J)和As(Ⅲ)(5.4±0.5J)。这主要由于As(Ⅲ)和Fe(Ⅱ)的物理化学作用在两者相互作用过程中所起的作用。As(Ⅲ)氧化成低毒As(V)、共沉淀或者吸附于Fe沉淀上,从而导致了溶液中As(Ⅲ)浓度的降低或者毒性的减低。这些复杂的相互作用就使得水环境中As(Ⅲ)的毒性降低。此外,将吸附As(Ⅲ), Fe(Ⅱ)及两种离子的混合物的Pseudomonas fluorescens,干燥后,FT-IR光谱表明Fe对细胞壁的功能团结构的影响较大,说明Fe产生了水解产物或沉淀,而As(Ⅲ)的影响没有观察到,这样可以说明沉淀是降低As(Ⅲ)浓度的一个途径。 为了了解不同环境污染物之间的作用机制,我们选择了邻苯二甲酸酯和碳纳米材料。二烷基邻苯二甲酸酯(Dialkyl phthalate esters (DPEs))具有内分泌干扰物的功能,被大量的使用于塑料制品并被划归为优先污染物。碳纳米管(Carbon nanotubes (CNTs))作为一种很强的吸附剂,能够影响到DPEs在环境中的归趋、迁移和有效性。对于CNTs的环境使用来说,理解DPEs和CNTs两者之间的吸附作用机制是非常有意义的。此研究中,评价了一种单壁碳纳米管(single-walled CNTs (SWCNT))和三种多壁碳纳米管(multi-walled CNTs (MWCNT))。对于特定的某一个碳纳米管,吸附力与DPEs的疏水性质有很大的关系,其顺序为邻苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate (DMP))邻苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate(DEP))邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate (DBP))。DPEs的标准化的吸附系数(K/KHW)表明对于DPEs (π-受体)吸附到CNTs (π-供体)上,π-πelectron-donor-acceptor (EDA)反应也是一个重要的影响因素。π-πEDA复合体(即混合芘(pyrene (PYR)) (π-供体)和DPEs)的电子转移键能表明反应强度顺序为:DMP-PYR DEP-PYR DBP-PYR。计算出了单层吸附容量(log Q),对于DMP和DEP,其数值大于评估的吸附容量(1og Q0)而对于DBP而言,两者的数值几乎相当,表明DPEs主要吸附于CNTs的表明。对于特定的DPE,吸附容量随着碳纳米管半径的增大而减少,其顺序为SWCNT MWCNT10 MWCNT20 MWCNT40。 通过以上研究,了解了重金属和农药对土壤微生物群落及不同形态铁对不同种类单一环境微生物的作用机制,为评价环境污染物对环境健康的影响提供了一条可行的途径。同时,研发了生物传感器也能有效的测定样品中的葡萄糖含量。最后,了解了碳纳米管与邻苯二甲酸酯类的相互作用机制,为进一步研究混合环境污染物在环境中的迁移转化、及对环境微生物的复合影响奠定了一定的理论基础。


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