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瓶霉Phialophora sp. G5来源的两个木聚糖酶基因的克隆表达及性质的研究

张帆  
【摘要】:半纤维素是自然界中仅次于纤维素含量第二丰富的可再生性资源,而木聚糖是半纤维素的重要组成部分。完全降解木聚糖需要多种酶的协同作用,而木聚糖酶是其中最重要的酶之一。木聚糖酶可以水解木聚糖骨架的β-1,4糖苷键,将木聚糖降解成木糖和低聚糖。木聚糖酶主要存在于微生物、植物和低等动物中,在饲料、造纸、能源和其他工业领域都具有广泛的应用前景,利用分子生物学技术,获得优良性质的木聚糖降解酶基因的研究越来越受到人们的关注。 本研究以云南锡矿酸性废水中分离得到一株具有木聚糖降解能力的瓶霉(Phialophora sp.)G5菌株为材料,通过生物信息学方法,对微生物来源的第10家族和第11家族木聚糖酶的氨基酸序列进行比对分析,同时结合丝状真菌已发表序列的比对结果,从而确定第10家族和第11家族木聚糖酶保守氨基酸的序列,随后采用Touchdown-PCR技术克隆木聚糖酶的保守片段,接着采用TAIL-PCR的方法克隆木聚糖酶的基因全长。从Phialophora sp.G5菌株中克隆到第10家族和第11家族木聚糖酶基因命名为xyn10G5和xyn11G5,通过比对结果显示与已知的木聚糖酶氨基酸序列最高一致性分别为53%和63%。 将木聚糖酶基因xyn10G5和xyn11G5在毕赤酵母中进行真核分泌表达,纯化达到电泳纯。纯化的木聚糖酶蛋白编号为XYN10G5和XYN11G5,比活分别为207.2 U/mg和857.1U/mg。通过性质测定发现,木聚糖酶XYN10G5的最适pH为4.0,在pH 3.0时仍能检测到30%的活力。在pH稳定性方面,该酶在pH 3.0~9.0的环境中于37°C处理1h,剩余酶活性维持在70%以上。最适温度为70°C,在70℃拥有良好的热稳定性。底物特异性结果表明其不仅对可溶性小麦阿拉伯木聚糖有很好的降解作用,对燕麦木聚糖,桦木木聚糖和榉木木聚糖也有中度的降解能力,并且还有微弱的纤维素降解能力。其水解木聚糖的产物主要为木糖,木二糖。在人工模拟胃液(GSF)的实验中,木聚糖酶XYN10G5能降低大麦豆粕型饲料的粘度,因此其在饲料行业具有潜在的应用前景。木聚糖酶XYN11G5的最适pH为5.0,最适温度为50°C,在中性范围的稳定性不错,对胃蛋白酶和胰蛋白酶有一定的抗性,水解木聚糖的产物主要为木糖,木二糖和木三糖。 本研究结果将为开发性质更特殊的和拥有更广泛应用前景的木聚糖酶提供研究方法,以及为进一步研究木聚糖酶结构与功能的关系奠定理论基础。


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