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GSH敏感巯嘌呤—羧甲基壳聚糖高分子前药的制备与性能研究

饶艳  
【摘要】:两亲性高分子前药具有提高药物的靶向性和药物的生物利用度,减少药物的毒副作用等优点,其生理环境下能自组装形成的前药纳米粒因尺寸较小能避免被网状内皮系统(RES)巨噬细胞吞噬,故在癌症的治疗方面备受关注。其中,由于二硫键在体内对谷胱甘肽浓度有特异响应性,并且细胞中的谷胱甘肽浓度(约10 mM)高于血液中的谷胱甘肽(GSH)浓度(约2-10μM),癌细胞中的谷胱甘肽浓度约为正常细胞内的四倍,基于二硫键的药物载体可以响应细胞内谷胱甘肽浓度变化从而将药物释放出来。利用这一特性将基于二硫键的高分子前药,以及其自组装前药纳米粒应用于癌症治疗是极具潜力的。 为了制备能响应细胞内谷胱甘肽浓度刺激的高分子前药,本研究利用异基双功能交联剂SPDP连接羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan, CMC)与巯嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)制备高分子前药巯嘌呤-羧甲基壳聚糖(6-mercaptopurine-carboxymethyl chitosan,6-MP-CMC)。这种GSH敏感型高分子前药在低浓度GSH(2-10μM)下能维持其结构,而在高浓度GSH浓度(2mM和10mM)下断开二硫键从而将药物释放出来。并且,该两亲性高分子前药在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中能通过自聚集作用形成纳米粒,该纳米粒在低浓度GSH浓度(2-10μM)下能维持其结构,而在高浓度GSH浓度(2 mM和10 mM)下纳米结构发生崩解。主要研究内容和结论如下: (1)以壳聚糖为原料,合成羧甲基壳聚糖。CMC首先与N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionate, SPDP)连接臂反应制备PDP-CMC,接着PDP-CMC与药物6-MP经巯基-二硫键交换反应制备巯嘌呤-羧甲基壳聚糖两亲性高分子前药;通过控制原料的物料比,合成了三种不同巯嘌呤含量的产物。中间产物和目标化合物的结构通过红外光谱和核磁共振谱进行表征;分别采用元素分析仪和紫外分光光度法测定PDP和6-MP的取代度。实验结果表明,经化合物结构表征确证成功合成了巯嘌呤-羧甲基壳聚糖;PDP基团的最高取代度为0.39;最高的巯嘌呤含量为19.0%。 (2)考察6-MP-CMC高分子前药体外释放性能。采用透析法研究了高分子前药在模拟血液中GSH浓度条件(2μM)和细胞内环境的GSH浓度条件(2mM和10mM)的释放介质中的体外释放行为,接着研究了模拟细胞质和内吞体内不同pH环境的释放介质(GSH浓度为10mM)中的体外释放行为,并比较不同巯嘌呤含量的6-MP-CMC高分子前药的体外释放性能。实验结果表明,6-MP-CMC在模拟血液环境的谷胱甘肽浓度条件下稳定存在,而在模拟细胞环境的谷胱甘肽浓度条件下可以快速释放出药物。并且随着谷胱甘肽的浓度的增加,药物的释放速率率也随之升高;6-MP-CMC不仅在细胞质条件pH 7.4下能维持快的释药速率和释放量,而且在内吞体pH 5.0条件下也能迅速的释放药物,其总累积释药率明显提高;另外,随着6-MP-CMC的巯嘌呤含量的增加,高分子前药在谷胱甘肽作用下越容易断链,药物的累积释放率也随着增加,这种现象在pH 5.0的模拟内吞体环境下更为显著。 (3)采用探针式超声法制备了巯嘌呤-羧甲基壳聚糖前药纳米粒。采用透射电镜考察了纳米粒的形态;采用动态光散射法测定了纳米粒的粒径;通过对不同谷胱甘肽浓度溶液中纳米粒的粒径大小及分布指数考察了纳米粒的谷胱甘肽敏感性。实验结果表明,经TEM观察,正常生理条件下,6-MP-CMC呈完整的单分散球形结构,纳米粒的平均粒径介于134.1-210.8 nm之间,且随着巯嘌呤含量的增加而减小。此外,该纳米粒具有谷胱甘肽敏感性,在模拟血液环境的谷胱甘肽浓度条件下能基本保持稳定存在,在模拟细胞内的谷胱甘肽浓度条件下发生结构崩解;且随着谷胱甘肽浓度的增加,这种纳米粒崩解现象愈加明显。 因此,巯嘌呤-羧甲基壳聚糖高分子前药具有能响应细胞内较高谷胱甘肽浓度刺激和可以自组装为前药纳米粒的特点,有望作为谷胱甘肽敏感型纳米前药,通过其表面靶向基团的引入,用于癌症靶向治疗。


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