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藻胆蛋白降解的蛋白质工程研究

周婷  
【摘要】: 藻胆蛋白是蓝藻进行光合作用必不可少的捕光复合体。本文采用分子生物学和蛋白质工程方法研究蓝藻藻胆蛋白的降解机制,将为从源头控制蓝藻生长、解决水华问题提供重要的帮助。 首先利用多质粒组合在大肠杆菌体内进行重组,得到了具有光学活性的色素蛋白PCB-CpcB(84位)和PCB-CpcB(155位)。对体内重组色素蛋白进行光谱分析,吸收光谱和荧光光谱均表明藻蓝胆素与脱辅基蛋白CpcB形成了共价连接,从而证实在大肠杆菌体内成功生成了色素蛋白PCB-CpcB(84位)和PCB-CpcB(155位)。藻胆蛋白体内重组的实验研究有助于进一步了解藻胆体的构成并对藻胆蛋白在实践中的应用具有重要意义。 然后将质粒pET-oA、pET-oB、pET-rA、pET-cA和pET-cpcA转化大肠杆菌获得表达菌种,进行大量表达,分别获得四种蛋白酶OA、OB、RA、CA与脱辅基蛋白CpcA。同时利用大肠杆菌大量表达并纯化了五种体内重组色素蛋白PCB-ApcA、PCB-ApcB、PCB-CpcA、PCB-CpcB(84位)和PCB-CpcB(155位)。 最后本文重点研究了OA、OB、RA、CA四种蛋白酶与藻胆蛋白降解之间的关系。首先在体外进行了这四种蛋白酶与脱辅基蛋白CpcA之间的复合物实验。实验结果表明四种蛋白酶与脱辅基蛋白之间均未形成复合物。其次进行了四种蛋白酶分别对五种色素蛋白PCB-ApcA、PCB-ApcB、PCB-CpcA、PCB-CpcB(84位)和PCB-CpcB(155位)的酶活性研究,并对不同温度下蛋白酶的活性大小进行分析比较。实验结果表明四种蛋白酶对于不同的色素蛋白活性显著不同,其中蛋白酶OA的酶活性最大,RA的活性次之,CA的活性最小,而OB对五种色素蛋白均没有活性。同时随着温度的升高,OA、RA和CA蛋白酶的活性显著升高。 酶活性实验证实了OA、RA和CA蛋白酶对于不同的色素蛋白均显示出酶活性,但活性又显著不同,说明藻胆体的降解机制十分复杂,藻胆蛋白的降解过程很可能存在多种酶的协同作用。三种蛋白酶可能都参与了藻胆蛋白的降解过程,但在降解过程的作用有所不同。OA蛋白酶酶活性最好,推测其参与藻胆蛋白的降解过程并可能发挥重要作用。但在复合物实验中并未发现OA等蛋白酶直接与CpcA形成复合物,说明蛋白酶与CpcA之间的相互作用虽然存在,但形成复合物的过程可能还需要其他辅助因子的参与,这需要在后继的研究中进一步探明。本文的研究结果将对藻胆蛋白降解机制的研究提供有用数据并为从分子生物学层次上解决蓝藻水华问题奠定重要的理论基础。


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