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嗜热真菌高产木聚糖酶及其酶法制备低聚木糖的研究

张新峰  
【摘要】:低聚木糖是由2~7个D-木糖以β-1,4-木糖苷键连接而成的低聚合度功能性多糖。在低聚木糖制备的多种方法中,酶水解法是最为方便有效、针对性好、可控性强的方法,而产木聚糖酶菌种的选择和工艺条件的优化成为能利用该方法的关键因素。本文以嗜热真菌Thermomyces lanuginosus DSM10635为出发菌株,采用原生质体紫外线和亚硝酸复合诱变方法,最终筛选出一株性能稳定且木聚糖酶高产的突变株(T-U-03-10),在此基础上进行诱变菌株液态发酵产木聚糖酶工艺的优化以及利用所产木聚糖酶制备低聚木糖的最适酶解工艺条件的研究。 1.本试验确定了该菌株原生质体制备的最适条件:酶系及酶解浓度为0.01g/mL纤维素酶+0.01g/mL蜗牛酶(体积比1:1混合),菌龄为58h,酶解时间为2.5h,酶解温度为30℃~34℃,稳渗剂为0.6mol/L的甘露醇;原生质体的数目可达4.47×10~6个/mL,再生率为4.74%。采用15W紫外灯30cm处照射原生质体5min,筛选出一株命名为T-U-03突变株,再以亚硝酸处理T-U-03原生质体120s,均通过透明圈初筛和摇瓶复筛,最后选育出一株木聚糖酶高产菌T-U-03-10,产酶活力高达1510U/mL,与出发菌株酶活1011U/mL相比,提高了49.36%。 2.首先通过单因素实验确定了最适碳源、氮源及表面活性剂,其分别为玉米芯、尿素、吐温-80;再利用SAS-JMP软件,对培养基的主要成分进行PB实验和响应面实验,确定了最佳培养基组分为:玉米芯为4.570%,尿素为1.797%,KH2PO4为0.497%,ZnSO4 0.2%,MgSO_4·7H_2O 0.03%,CaCl_2 0.03%,FeSO_4·7H_2O 0.03%,Tween-80 0.03%以单因素方法确定了最适发酵条件为:接种量为培养基中孢子数约10~5~10~6个/80mL,培养时间7d,培养基初始pH6.5~7.0,发酵温度50~52℃,转速180~200r/min,装液量90mL/250mL。在此条件下,菌株的产酶活力高达到1726.80U/mL,较优化前酶活提高了14.36%。 3.初步探讨了该突变株产酶的基本酶学性质,其结果为:该酶对底物的特异性较强,最佳反应温度为65℃,热稳定范围不高于65℃,则该酶的稳定性较好。酶促反应最适pH值为6.8且在该条件下酶的稳定性较好,其存活率仍为85.20%。低浓度的Mg~(2+)、Mn~(2+)和高浓度的Fe~(2+)、Zn~(2+)对该酶都具有明显的的激活作用;但Hg~(2+)对该酶抑制作用极大,甚至在高浓度下使酶完全失活,而Cu~(2+)、Co~(2+)也均有较大的抑制作用,其失活率分别在10.40%和19.46%。该酶液在室温下保存不稳定,应尽量置于4℃低温下保存。经测定木聚糖酶的米氏常数约为38.71mg/mL,最大反应速率约为277.78μmol/(mL.min)。 4.采用嗜热真菌产的木聚糖酶来制备低聚木糖,且主要对酶解工艺条件进行了探讨。通过单因素及正交试验确定出低聚木糖酶法制备的最佳工艺条件为:酶解时间为2.5h,底物浓度为4%,酶的添加量为每克底物加酶量120U。酶解液经碳柱过滤纯化后,由HPLC分析测定该糖液主要成分为木二糖、木三糖及木四糖其含量占低聚木糖组分约74.56%。


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