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产木糖苷酶菌株的诱变育种、发酵优化、酶学特性及应用研究

汤勇  
【摘要】:可再生半纤维素的主要成分木聚糖降解为单体木糖的过程需要一系列酶的共同参与。该多糖的基本骨架为β-1,4糖苷键相连的D-吡喃木糖,并且含有以下侧链取代基,如乙酰基、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸。木聚糖的完全降解需要完整的木聚糖水解酶系,主要包括β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。本实验中所使用的黑曲霉(Aspergillus niger)可以产β-木糖苷酶和木聚糖酶,其中β-木糖苷酶水解可溶性低聚木糖和木二糖的非还原末端释放木糖。本研究首先对实验室保藏的一株黑曲霉产木糖苷酶的发酵条件和发酵培养基进行了优化。通过单因素优化实验确定了该菌产木糖苷酶的最优发酵条件。通过Plackett-Burman设计试验、Central Composite Design中心复合试验等方法确定了该菌株产木糖苷酶的最适发酵培养基组分。然后对该菌株进行紫外诱变筛选出一株高产木糖苷酶的菌株,并对其进行二次优化。最后对分离纯化后的木糖苷酶进行了表征,同时研究了该酶与木聚糖酶协同作用,主要研究结果如下。(1)确定实验室保藏菌株黑曲霉(Aspergillus niger)为出发菌株。通过测定细胞干重的方法测得该菌株的生长曲线,选取36h为种子培养时间。采用单因素实验、Plackett-Burman设计实验、Central Composite Design设计实验等方法确定了该菌株产木糖苷酶的最优发酵条件为发酵时间144h,发酵温度34℃,接种量7%,摇瓶转速为180 r/min,装液量110 m L/300m L,初始发酵p H为3.5。最佳发酵培养基组成为玉米芯粉31.55 g/L,酵母粉8.00 g/L,蛋白胨5.48 g/L,硫酸镁0.70 g/L,氯化钠1.00 g/L,氯化钙1.50 g/L。预测酶活为15.04 U/m L实测酶活为14.87 U/m L,结果相近,说明上述优化方法得到的实验结果是合理可信的。优化发酵条件和培养基组成后,木糖苷酶酶活是优化前的8.89倍。(2)对原始菌株CAN进行紫外诱变,紫外照射最佳时间为1.5 min,获得紫外诱变突变株CANT,经摇瓶发酵测定酶活为25.12 U/m L,比CAN提高了69%左右,并且具有良好的遗传稳定性。测定其生长曲线,选取40 h为种子培养时间。(3)采用单因素实验、Plackett-Burman设计实验、Central Composite Design设计实验等方法方法得到该菌株产木糖苷酶的最优发酵条件为发酵时间156 h,发酵温度34℃,接种量5%,摇床转速为160 r/min,装液量110 m L/300m L,初始发酵p H为4.0。最佳发酵培养基组成为玉米芯粉40.00 g/L,酵母粉5.00 g/L,蛋白胨22.41 g/L,磷酸二氢钾0.50 g/L,磷酸氢二钾0.50 g/L,硫酸镁0.50 g/L,氯化钠1.00 g/L,氯化钙1.50 g/L。预测酶活为47.02 U/m L实测酶活为46.77 U/m L,结果相差不大,说明采用上述一系列优化方法得到的实验结果是合理可靠的。优化发酵条件和培养基组成后,木糖苷酶酶活是优化前的1.86倍,是出发菌株CAN的27.97倍。(4)通过一步盐析和三步层析等分离纯化步骤,,最终得到纯化倍数33.68,比酶活1954.23 U/mg的高纯度酶蛋白,SDS-PAGE测得分子量约为121.0 KDa。对电泳纯的木糖苷酶进行表征,该木糖苷酶最适反应温度为70℃,在30℃~60℃范围下4 h后相对残留酶活仍有75%;最适反应p H为4.0,在p H 4~p H 10范围下4 h后相对残留酶活仍有70%。研究了木糖苷酶和木聚糖酶一起降解玉米芯粉的协同作用,两种酶一起降解玉米芯粉得到还原糖的量是单木聚糖酶降解产生还原糖量的347.1%。对两种酶降解玉米芯粉的产物进行了分析,发现单一木聚糖降解玉米芯粉的主要产物为木糖、木二糖、木三糖、木四糖等低聚木糖,两种酶一起降解玉米芯粉的主要产物对比单一木聚糖酶的降解产物中木糖含量明显增加,木二糖、木三糖、木四糖等低聚木糖的含量减少。


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