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酵母生物转化合成苯乙醇的研究

李可  
【摘要】:苯乙醇(2-phenethyl alcohol)是一种具有类似玫瑰蜂蜜香气的高级芳香醇,被广泛应用于化妆品行业、食品行业以及制药行业。目前主要通过天然提取法、化学合成法以及微生物生物转化合成法合成苯乙醇,其中微生物转化合成因其被食品行业标注为天然产品,发酵周期短,成本低,具有更高的经济效益而受到广泛关注。本文以鲁氏酵母和酿酒酵母为研究对象,探究其合成苯乙醇能力。主要研究工作如下:(1)鲁氏酵母M2013310在YPD液体培养基中发酵至稳定期,利用气相色谱-质谱联用仪(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)分析鲁氏酵母M2013310挥发性芳香物质成分,发现挥发性香味物质中含有苯乙醇,说明该菌株具有转化合成苯乙醇的能力。第三代测序(Pac Bio)技术对菌株进行全基因组测序,组装和注释。鲁氏酵母M2013310全基因组总长度为7.30 Gb,共注释9043个基因,对比菌株鲁氏酵母CBS732和酿酒酵母S288c,分析结果表明该菌株为二倍体菌株,KEGG数据库分析该菌株具有合成苯乙醇的莽草酸途径和艾氏途径。(2)鲁氏酵母M2013310可耐受4 g/L苯乙醇。鲁氏酵母M2013310在M3(NH_4~+),M3(Phe),M3(Phe+NH_4~+)培养基中发酵72 h后,苯乙醇最终产量分别可达3.80 mg/L,3.58 g/L和1.79 g/L,说明鲁氏酵母M2013310可通过莽草酸途径合成苯乙醇且艾氏途径为合成苯乙醇的主要代谢途径。该菌株氨基酸转运酶ARO8和ARO9,脱羧酶ARO10和PDC1,脱氢酶ADH2,调控因子ARO80并非氮代谢阻遏(NCR)敏感基因,培养基中硫酸铵的存在主要影响苯丙氨酸转运进入胞内,从而导致苯乙醇产量的降低。(3)酿酒酵母FY20001可耐受4 g/L苯乙醇。酿酒酵母FY20001在以苯丙氨酸为唯一氮源的培养基中苯乙醇浓度最高可达3.90 g/L。M3(Phe+NH_4~+)培养基中苯丙氨酸耗尽且苯乙醇产量高达3.20 g/L,偏好型氮源硫酸铵存在不会影响苯丙氨酸转运进入胞内。此外,酿酒酵母FY20001的实时荧光定量PCR(q RT-PCR)数据表明,该菌株渗透酶GAP1,转氨酶ARO8和ARO9,脱羧酶ARO10为氮代谢阻遏敏感基因,硫酸铵存在抑制了上述基因的表达。


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