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喹噁啉类在大鼠和猪肝微粒体中脱氧速率与肝细胞中毒性的研究

张华海  
【摘要】: 喹噁啉类是化学合成的具有抗菌、促生长作用的动物专用药,包括卡巴氧、喹乙醇、喹赛多、喹烯酮和乙酰甲喹等。因毒副作用,卡巴氧和喹乙醇已被禁止或限制使用。我国相继批准了乙酰甲喹和喹烯酮的使用,并正在开发安全的喹赛多等同类产品。喹嗯啉-N-一氧化物的毒性比喹嗯啉-N1,N4-二氧化物低,完全脱氧的喹噁啉无毒性,因此喹嗯啉-N1,N4-二氧化物脱氧速率越快,毒性丧失越快。喹嗯啉类母环结构完全相同,都会发生相同的N→O基团还原反应,生成脱氧代谢物。不同化合物由于侧链不一样,会对脱氧速率产生影响。脱氧快慢存在明显差异,这种差异是否与其脱氧速率快慢相关尚无直接的研究证据。此外,研究表明,含有N-N-二氧基团的化合物在脱氧的同时会产生超氧阴离子和OH自由基,导致DNA损伤、线粒体损伤、细胞凋亡等氧化应激毒性反应。喹噁啉类是否会产生类似的毒性反应尚值得探讨。因此为了揭示喹噁啉类脱氧速率与毒性的关系,进一步研究喹噁啉类的脱氧速率与氧化应激毒性关系是非常必要的。 本课题通过体外研究法探研了喹噁啉类药物在肝微粒体中的脱氧速率和在原代肝细胞中的氧化应激毒性,在此基础上,结合实验室前期研究结果深入分析了脱氧速率与主要毒性指标之间的相关性,为阐明喹嗯啉类的毒性机理和毒性差异提供科学依据。 采用差速离心法制备大鼠和猪肝微粒体,喹嗯啉类与微粒体在低氧和有氧条件下37℃孵育,用LC/MS-ITTOF鉴定脱氧产物,HPLC法进行相对定量,比较了喹嗯啉类在肝微粒体孵育体系中脱氧速率,并考察了NADPH和NADH两种辅酶对还原反应的影响。结果显示,在辅酶NADPH和低氧条件下:喹赛多、喹乙醇、乙酰甲喹、卡巴氧和喹烯酮在大鼠肝微粒体中的脱一氧生成速率分别为:1.74、1.94、1.99、5.48和20.81 min,脱二氧生成速率分别为:35.36、43.86、231、67.94和630min;在猪肝微粒体中脱一氧生成速率分别为1.93、2.16、2.36、6.07和27.02 min,脱二氧生成速率分别为:36.28、44.14、223.55、72.19和693 min。在辅酶NADH和低氧条件下,喹赛多、喹乙醇、乙酰甲喹、卡巴氧、喹烯酮在大鼠肝微粒体中的脱一氧生成速率分别为5.38、8.51、9.16、27.61和51.33min;猪肝微粒体中脱一氧生成速率分别为6.35、13.54、20.69、29.24和113.61 min。在辅酶NADH和低氧条件作用下,大鼠肝微粒体中脱二氧产物很少,猪中未检测到脱二氧产物;在有氧条件下通过HPLC也检测不到脱二氧产物。此类药物脱氧具有很强的低氧偏好,低氧条件下脱氧产物浓度比有氧脱氧产物浓度要高6-10倍左右。综上所述,五种喹噁啉类药物脱一氧生成速率为喹赛多喹乙醇乙酰甲喹卡巴氧喹烯酮,脱二氧生成速率为喹赛多喹乙醇卡巴氧乙酰甲喹喹烯酮。 采用组织消化法制备原代肝细胞,分别与五种喹噁啉类药物在5%CO2,37℃孵育4h后,染毒剂量为5μmol/L,25μmol/L,50μmol/L,同时设置空白对照组和溶剂对照组。通过测定细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)和细胞胞内谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)含量变化来反应氧化应激毒性。结果表明,与空白对照组相比,五种药物均可以导致LDH上升和GSH下降,SOD先上升后下降,具有剂量依赖性,随剂量增大毒性增大。喹烯酮5μmol/L染毒组导致SOD显著上升(p0.05)。乙酰甲喹和喹烯酮染毒浓度大于25μmol/L时导致SOD和GSH下降极显著(p0.01)、LDH上升极显著(p0.01),喹烯酮变化明显。卡巴氧染毒浓度大于25μmol/L时导致SOD和GSH显著下降(p0.05),LDH显著上升(p0.05)。喹乙醇25μmol/L时导致LDH显著上升(p0.05),50μmol/L时LDH上升极显著(p0.01)。喹赛多在浓度50μmol/L时,SOD、LDH和GSH变化才表现出显著差异(p0.05)。由此看出喹烯酮毒性和乙酰甲喹毒性较大,其次是卡巴氧和喹乙醇,喹赛多毒性最小。 采用两个变量相关分析法,分析了不同条件下脱一氧和脱二氧的生成速率与LD50、NOAEL、SOD、GSH和LDH之间的相关性。结果表明,喹赛多、喹乙醇、乙酰甲喹、卡巴氧和喹烯酮脱一氧和脱二氧生成速率与LD50、NOAEL、GSH和SOD之间呈负相关,与LDH呈正相关,说明脱氧越快,毒性越小;脱一氧生成速率与LD50呈实相关(r0.5),与体外氧化应激毒性呈显著相关(r≈0.5),脱二氧生成速率与LD50呈显著实相关(r0.5),与体外氧化应激毒性呈高度相关(r0.8)。可以看出,脱二氧生成速率比脱一氧生成速率与体内和体外毒性指标之间相关性高。五种药物脱二氧生成速率大小可以作为氧化应激毒性大小的判断依据。 本课题在体外体系中,首次系统的研究了喹嗯啉类在肝微粒体中脱氧速率和对原代肝细胞的氧化应激毒性,分析了毒性大小与脱氧速率的关系,初步认为脱二氧生成速率大小可以作为喹嗯啉类毒性高低的判断依据之一,提出了喹噁啉类药物脱氧与氧化应激毒性的可能原理。为喹噁啉类毒性作用机制研究提供理论依据。


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