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长江草鱼群体MHC Class Ⅱ B基因的克隆、表达及多态性分析

张燕  
【摘要】: 主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)是在脊椎动物中发现的编码免疫球蛋白样受体的高度多态的基因群,并且其某些基因型与生物体抗病能力存在一定的关联关系。本研究以我国重要淡水养殖经济鱼类草鱼为实验材料,利用PCR、RT-PCR等技术研究了MHCⅡB基因的克隆、表达、等位基因的多态性以及等位基因的多态性与鱼体抗病力之间的关系,为筛选抗病相关MHCⅡB基因标记和建立基因标记辅助选育技术提供基础。(1)克隆及测序了草鱼长江3个群体的主要组织相容性复合体(MHC) ClassⅡB基因编码β1和β2区的第2和第3个外显子及两个外显子之间的内含子,分析了草鱼MHC的进化模式和种群遗传结构。结果共定义了34个等位基因,每条序列包括长为130-136bp的第2个外显子,长为218bp的第3个外显子以及长81-371bp的内含子。序列分析揭示,第2个外显子有106个核苷酸变异位点(78%)和40个氨基酸变异位点(88%),而第3个外显子有100个核苷酸变异位点(45%)和41个氨基酸变异位点(56%),β1变异要大于β2区。用邻接法(NJ)分别构建的β1和β2序列系统树均获得5个高支持率的谱系,结合序列变异特点和内含子长度,推测草鱼至少存在5个MHC ClassⅡ座位。分别计算β1的肽结合位点(PBR)、非肽结合位点及β2的非同义替换率(dN)和同义替换率(dS),结果显示PBR的dN/dS为2.03(p0.05),非肽结合位点和p2则小于1,表明草鱼MHC受到歧化选择作用。根据不同群体中MHC等位基因分布频率的分子方差分析(FST=0.37%),长江草鱼群体间无遗传分化。(2)用嗜水气单胞菌感染健康草鱼,分别在感染5h、16h、40h、64h、88h、112h时收集草鱼各组织材料提取总RNA,另取健康草鱼组织作对照。以反转录合成的第一链cDNA为模板,应用RT-PCR半定量检测方法对草鱼感染嗜水气单胞菌前后的MHCⅡB基因组织表达特点进行了研究。结果表明,在正常草鱼组织中,除脑组织以外,MHCⅡB基因均扩增出约350bp的片段,MHCⅡB基因较强的表达于肾脏、心脏和肠中,中等程度表达于肝脏、脾脏和鳃中,在肌肉中表达最弱。嗜水气单胞菌感染后,在草鱼的肝脏、肾脏、心脏、肠和鳃组织中,感染初期MHCⅡB基因表达量都有所下降,而在感染88h的时候MHCⅡB基因表达量在所有时间点中达到最大,感染112h后表达量慢慢回落至正常值;其中肠组织在112h时,MHCⅡB基因表达水平依旧较高。脾脏在感染后,表达量总体处于上升趋势,88h时表达量达到最大值,112h后慢慢回落至正常值。


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