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鸡胚性分化早期性别差异表达miRNAs的鉴定及其特性分析

黄潘  
【摘要】: miRNA是近年来新发现的一类在转录后水平下调基因表达的小分子非编码RNA家族。研究发现,IniRNA在动物发育过程中发挥着重要作用,但它在鸡胚性腺分化中的调控作用还未确定。为研究miRNA在鸡胚早期性分化过程中的表达,探讨miRNA在性腺早期发育中的作用,本研究以前期芯片筛选出的差异表达miRNAs为研究对象,对其中新的miRNAs进行生物信息学分析,并分析了候选miRNAs在雌、雄鸡胚早期性腺中的时空表达模式。本研究所取得的结果如下: 1.利用鸡基因组信息对新miRNAs进行定位,发现miR-363和363*、miR-551b和miR-612分别位于鸡染色体4(-)、9(-)和Z(-)上,同时通过克隆获得了miR-363*在鸡基因组上的未知侧翼序列。前体的二级结构折叠结果表明,预测的鸡新miRNAs均具有茎环状前体结构,成熟序列基本位于相应的茎部,且折叠最低自由能均≤-25kcal/mol。miR-363 (363*)和miR-551b在人、大鼠、小鼠和鸡4个物种中的同源性分析结果表明,前体序列的相似性均在80%以上,且成熟序列中仅有个别碱基的差异。 2.利用RNA加尾及引物延伸和茎环状引物的半定量RT-PCR方法分析了13个miRNAs在E3.5-6.5 d雌、雄鸡胚性腺中的时间表达谱,并对它们在同一时期不同性别中以及同一性别不同时期中的差异性进行了显著性分析。结果表明,从总体趋势看,所检测miRNAs中有5个呈雌性高表达和4个呈雄性高表达,其余4个为不规则表达;miR-363、miR-200b、miR-1810、miR-1599、miR-551b和miR-196在所检某些时期两性间的差异表达达到显著或极显著水平;miR-363、miR-1456、miR-196、miR-363*、miR-612、miR-1599、miR-126和miR-1810在同一性别某些时期间的表达存在显著或极显著差异。 3.利用WISH技术对miR-363和miR-1810进行空间表达模式分析,结果表明,miR-363主要在E4.5 d鸡胚的四肢、外胚层、脊索以及脑等部位表达,在E6.5 d性腺部位的表达明显高于肾脏,且在雌性性腺中的表达高于雄性;miR-1810主要在E4.5 d鸡胚的脑和四肢表达,在E6.5及E8.5 d性腺中表达高于肾脏,且雄性性腺中的表达高于雌性。 结合本研究结果及其它物种中相应miRNA的研究,筛选了5个(miR-363、miR-551b、miR-1810、miR-1599和miR-200b)可能参与早期鸡胚性腺发育过程的miRNAs作为下一步研究的对象。


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