猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞的膜泡运输机制的研究

【摘要】： PRRSV是正链带囊膜的RNA病毒,PRRSV感染先与易感细胞表面硫酸乙酞肝素结合发生吸附,随后与唾液酸粘附素的结合引发网格蛋白介导内化进入细胞形成内体小泡。内化进入细胞后PRRSV需要解聚将其基因组释放并进入细胞浆才能产生感染性病毒粒子。在此过程中除了清道夫受体CD163和pH的降低等因素外,一些蛋白酶活性的分子也是PRRSV感染侵入所必须的。然而相对于PRRSV的吸附内吞过程,PRRSV借助何种膜泡运输机制最终突破囊膜屏障释放其基因组进入细胞浆还一无所知。目前大多数病毒,包括PRRSV,在感染宿主细胞的过程中是通过特异性的吸附在细胞表面而被细胞以“主动胞饮”的方式内吞,然后进入细胞内主要分选站早期内含体,之后走向经典的内吞—溶酶体途径,或循环内含体膜泡转运途径。然而许多病毒在进入内吞—溶酶体死亡途径前在内膜系统中pH、离子浓度等因素作用下引发病毒穿刺进入细胞浆产生感染性病毒粒子。 Rab蛋白是介导细胞内膜泡运输的具有GTP酶活性的开关分子,同时也是作为各内含体膜泡的标志性蛋白,已广泛用于定位细胞内各种内含体膜泡的研究,如Rab5定位早期内含体、Rab7定位晚期内含体、Rab11定位近核循环内含体。因此我们以Rab蛋白与PRRSV的共定位实验结合Rab蛋白负调控突变体对PRRSV感染的抑制试验确定PRRSV内吞后膜泡运输途径,DsRED-Rab5/7/11与PRRSV的共定位实验结果显示PRRSV能与Rab5/7共定位,另外Rab5/7蛋白负调控突变体实验也显示Rab5/7负调控突变体能明显抑制PRRSV感染,抑制效果分别为70%、30%-80%,因此PRRSV感染依赖于早期内含体和晚期内含体的膜泡运输,而近核循环内含体膜泡运输与PRRSV感染无关。 另外与囊泡运输相关的PI3K途径(磷脂酰肌醇激酶途径),通过与Rab5互作共同调节早期内含体的膜泡运输与融合,为了更好的解析PRRSV感染过程中的早期内含体膜泡运输过程,我们以PI3K的抑制剂LY294002干扰细胞早期内含体膜泡运输过程来确定其在PRRSV感染中的作用,结果表明LY294002对PRRSV在Marc-145中的感染无明显抑制作用,因此PRRSV的感染可能通过不依赖于PI3K的非经典早期内含体膜泡运输途径介导。 PKC是另一与囊泡运输相关的信号分子,与Rab11共同调节近核循环内含体的运输。同样为了更好的解析PRRSV感染与近核循环内含体膜泡运输的关系,我们以PKC的抑制剂bisindolylmaleimide (BIM) I干扰细胞近核循环内含体膜泡运输过程来确定其在PRRSV感染中的作用,结果表明PRRSV在Marc-145中的感染与BIM-I无关,与之前Rab11介导的循环内含体膜泡运输与PRRSV感染无关相吻合。