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IL-6与GM-CSF基因融合表达生长抑素基因疫苗对小鼠生长的影响

赵兴华  
【摘要】: 白细胞介素-6(IL-6)是常用的免疫增强剂。为了探讨其在基因免疫中的免疫增强作用,本研究应用基因克隆、细胞培养、酶联免疫测定、RT-PCR等技术,首先克隆了牛的IL-6基因,在生长抑素DNA疫苗pGS/2SS-asd基础上插入牛的IL-6基因,构建非抗性筛选生长抑素真核表达质粒pGS/2SS-IL6-asd,并电转化至缺失asd基因的减毒猪霍乱沙门氏菌,将重组菌肌注免疫小鼠后,旨在:①探讨IL-6和GM-CSF融合表达对生长抑素DNA疫苗免疫反应和增重效果的影响;②评估其安全性,为开发安全、高效的促生长DNA疫苗,加快其临床应用奠定基础。 1.牛IL-6基因克隆和序列分析 用ConA、PHA体外刺激诱导牛外周血单核细胞(PBMC),提取单核细胞总RNA后,利用RT-PCR克隆牛IL-6基因。序列分析表明,牛IL-6基因cDNA开放阅读框为624bp,与Genbank数据库中登载的牛IL-6序列(序列号:X57317.1)进行序列比较,结果有99.84%的同源性。将牛的IL-6基因插入T载体(pEASY-T1-simple)保存。 2.非抗性筛选生长抑素真核表达质粒pGS/2SS-IL6-asd的构建与鉴定 将牛IL-6基因插入到pGS/2SS-asd质粒的下游,构建带有IL-6和GM-CSF融合表达的非抗性筛选生长抑素真核表达质粒pGS/2SS-IL6-asd。酶切、测序鉴定结果表明,基因的插入位点、方向、序列完全正确。RT-PCR结果表明,pGS/2SS-IL6-asd质粒转染细胞48h后能检测到转录产物。 3.非抗性筛选生长抑素DNA疫苗pGS/2SS-IL6-asd免疫小鼠的免疫反应和促生长效果 将所构建的质粒pGS/2SS-asd电转化至缺失asd基因的减毒猪霍乱沙门氏菌C500,获得非抗性筛选生长抑素DNA疫苗C500(pGS/2SS-asd)。将50只雌性昆明小鼠随机分为6组,A、B、C三组分别用3种剂量(1×1010CFU/只,1×109CFU/只,1×108CFU/只)pGS/2SS-IL6-asd疫苗进行免疫;D组免疫不带IL-6的C500基因疫苗,即pGS/2SS-asd,剂量为109cfu/mL;E组免疫沙门氏菌空菌C500(109cfu/mL),F组免疫PBS。各组免疫方式均为肌肉注射,体积为0.2mL。在首次免疫后,第2周,用同等剂量的疫苗或对照液进行加强免疫一次。并分别在0(初次免疫前)、14(二免前)、28、42和56天同一时段采血。ELISA结果显示,A、B、C、D组小鼠均可以检测到抗SS抗体,且随免疫时间的延长,呈现升高的趋势。pGS/2SS-IL6-asd高剂量组和中剂量组取得了较高的抗体水平,极显著高于低剂量组和(?)pGS/2SS-asd组(p0.01)。每周称量小鼠体重,发现pGS/2SS-IL6-asd高剂量组增重效果明显高于低剂量组和(?)pGS/2SS-asd组。综上所述,IL-6和GM-CSF融合表达对生长抑素DNA疫苗有一定的免疫增强作用,pGS/2SS-IL6-asd效果要优于pGS/2SS-asd。4.染色体整合分析 将试验末期雌性昆明小鼠处死后,采集心、肝、脾、肺、肾、卵巢和肌肉组织,提取基因组DNA,PCR法检测质粒DNA的染色体整合情况。结果表明,在PCR的最大灵敏度(10拷贝/μg基因组)范围之内,没有发现质粒整合至基因组,提示即使发生整合突变,其发生频率也低于自发突变至少两个数量级。


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