希金斯刺盘孢T-DNA插入体库的构建、筛选及相关突变体基因的克隆

【摘要】：希金斯刺盘孢(Colletotrichum higginsianum Sacc.)是十字花科蔬菜炭疽病的病原菌,它属于子囊菌亚门,是一种半活体营养型的病害真菌。本研究以希金斯刺盘孢Ch-1菌株为出发菌株,利用农杆菌介导转化法获得2000多个T-DNA随机插入突变体,为进一步研究病原菌的致病机理提供了必要的材料。通过对突变体进行生物学特性分析,并以拟南芥为寄主植物做致病性测定,对突变体进行了初步筛选并将其分类,其中,2株生长缓慢,菌落不能均匀扩展；4株致病性减弱；3株产孢缺陷,在PDA平皿上不能产生分生孢子；4株产孢量增多；2株可以诱导寄主产生过敏性坏死；13株色素异常；2株菌落扇变；3株附着孢萌发异常。 对突变体Pch-1E393和Pch-1C36进行了深入详细的研究。突变体Pch-1E393生长速度明显减慢,菌丝粗壮稀疏,与Ch-1相比差异显著,但对拟南芥的致病力与菌株Ch-1无显著差异,此突变体在侵染过程中能产生正常的黑色附着孢并能产生初生菌丝和次生菌丝。Southern杂交证实在Pch-1E393中T-DNA标记为双拷贝插入。采用反向PCR技术对突变体Pch-1E393中T-DNA标记插入位点的侧翼基因组序列进行克隆,经过序列分析,表明T-DNA插入破坏的基因包含一个1432bp的完整开放阅读框,包含三个内含子、四个外显子,编码一个352个氨基酸的蛋白。将推定的蛋白氨基酸序列进行同源性对比(blsatp),发现该序列与禾生炭疽菌(Glomerella graminicola)的减数分裂重组蛋白DMC1 (meiotic recombination protein DMC1)具有高度同源相似性,相似度为86%,此蛋白在减数分裂过程中参与同源重组。 突变体Pch-1C36菌落灰白色,菌落中间呈黑色并塌陷,与Ch-1的菌落形态差异明显,但致病性、生长速度、孢子产量等其他生物特性与Ch-1无明显差异。Southern杂交证实T-DNA标记在Pch-1C36中为双位点插入。采用反向PCR技术对突变体Pch-1C36中T-DNA标记插入位点的侧翼基因组DNA进行克隆,经过序列分析,表明T-DNA插入破坏的基因包含一个690bp的完整开放阅读框,包含两个内含子、三个外显子,编码一个174个氨基酸的蛋白。将推定的蛋白氨基酸序列进行同源性对比(blsatp),发现该序列与endoribonuclease L-PSP (liver perchloric acid-soluble protein)同源性最高,L-PSP是在老鼠中,第一个被鉴定为单链RNA的特异性核酸内切酶。