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紫云英共生固氮基因AsIA257和AsIB259的功能研究

石晓峰  
【摘要】:AsIA257是本实验前期通过抑制差减杂交技术,分离克隆的紫云英共生特异表达的二磷酸核苷磷酸酯酶(Diphosphonucleotide phosphatase, PPD)基因。核苷酸和氨基酸序列均与紫色酸性磷酸酶(Purple acid phosphatase, PAP)家族成员特别是来自黄羽扇豆的PPD1高度相似,推测其编码蛋白属于PAP中的PPD亚家族。 本文通过构建AsIA257融合红色荧光蛋白和荧光定量PCR技术,研究了该基因的亚细胞定位和时空表达特征;进一步获得了AsIA257超表达植株,并检测了其结瘤表型。组织表达特征表明:AsIA257在接种后的根和根瘤中特异表达,且根瘤中·的表达量是根的5倍以上;在接种后27天表达量达到最高,随后又逐渐降低;同时在不固氮的无效根瘤中表达量显著增强。胁迫处理实验结果表明:氮胁迫,盐胁迫,黑暗处理时该基因表达量明显降低,但磷胁迫处理时,该基因大量表达,提示该基因可能与磷代谢有关。AsIA257融合红色荧光蛋白的洋葱表皮亚细胞定位结果显示:该蛋白定位于细胞膜上。紫云英根瘤的亚细胞定位结果显示:该基因定位于共生体膜上。以转化了空载体的根瘤为对照,Real-time-PCR检测结果表明:在接种后15天、27天和32天的根瘤中AsIA257均被超量表达,且超表达植株生长弱小,叶片发黄,结瘤数量显著减少为对照组的1/3。 另外,本实验同时获得了AsIB259超表达转基因植株,实验结果显示其结瘤数量增加。 以上结果初步揭示了共生特异表达的AsIA257和AsIB259基因在固氮过程中的调控功能,为深入研究其调控机制奠定了良好的工作基础


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