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水稻组织特异启动子的克隆及功能分析

魏晶  
【摘要】:水稻是世界上重要的粮食作物之一,是我国最重要的粮食作物。随着生物技术的迅速发展以及转基因水稻的研究逐渐深入,对于驱动外源片段表达的启动子的要求越来越高。启动子是在转录水平上调控基因表达的重要的顺式元件,它决定了基因表达的时间、组织及表达量的高低。分离克隆不同的组织特异性启动子对于转基因水稻的培育具有重要的意义。 本研究利用RT-PCR技术筛选水稻组织特异性表达的基因,分离克隆其上游的启动子,将报告基因gus与这些启动子融合,然后通过农杆菌介导法转化入水稻粳稻品种中花11(ZH11)中,最后通过对不同时期的不同组织进行GUS染色和定量来检测启动子的表达模式和强度,为转基因水稻的培育提供有用的资源。主要研究结果如下: 1.使用本室水稻芯片数据库,分析基因的表达谱,挑选到20个组织特异性表达的基因,其中2个经RT-PCR验证为叶片特异性表达,2个为茎杆特异性表达基因,1个为组成型表达基因。 2.通过生物信息学分析获得17个基因上游启动子序列,采用PCR扩增的方法成功克隆到17个启动子P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P13、P14、P15、P16和P17,长度分别为1.2 kb、1.9 kb、1.97 kb、2.0 kb、1.7 kb、1.4 kb、1.9 kb、1.9 kb、2.0 kb、1.95kb、2.0kb、1.9kb、1.66 kb、2.0 kb、2.0 kb、1.9kb和0.93kb。将P1、P2、P3和P4克隆到表达载体pGWGUS,其余启动子克隆到表达载体DX2181B上,与gus报告基因融合。 3.通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,将各重组质粒转入粳稻品种中花11中,分别得到转基因阳性植株29株、17株、37株、38株、33株、32株、30株、41株、34株、28株、37株、46株、36株、20株、32株、48株和28株。 4.经GUS染色检测得到1个叶片和胚特异的启动子P2,1个茎杆特异的启动子P3,2个雄蕊和胚特异表达启动子P6和P7,1个叶枕特异性启动子P9,2个组成型启动子P11和P12,2个叶枕和雄蕊特异性启动子Plo和P17。 5.经GUS活性测定得到P12启动子活性是Ubiquitinn的1/2-1/3,但P1z在水稻中比Ubiquitin稳定性高。 6.利用特异性启动子改造了6个植物表达载体pCAMBIA1300s(P2)、pCAMBIA1300s(P6)、pCAMBIA1300s(P9)、pCAMBIA1300s(P11) pCAMBIA1300s(P12)、pCAMBIA1300s(P17)。


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