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环介导等温扩增技术(LAMP)检测三种典型肠病毒方法的建立及其在水环境中的应用

杨丽  
【摘要】:随着水环境日益恶化,水污染问题已成为关注的焦点和研究的热点。现已有许多由于饮用水受到病原微生物污染而导致大范围群感染致病的记载,通过水传播的病原微生物以细菌、病毒和原生动物为主,常规氯消毒可有效杀灭细菌,但病毒在水环境中存活力很强,常规水处理工艺不能有效的将其去除。因此,检测环境水体中病毒是预防疾病暴发、评估水源卫生质量和环境卫生状况的一项很有价值的工作。本文新建了环介导等温扩增技术用于检测水环境中三种引起腹泻典型肠病毒,设计了每种病毒的专用引物,分别对其扩增条件(镁离子浓度、甜菜碱浓度、反应时间、反应温度)进行了优化,并检测了其特异性及灵敏度。然后将优化之后的LAMP检测方法用于北京饮用水及再生水中三种典型肠病毒的检测。具体结论如下: 1、星状病毒LAMP最佳反应条件为:镁离子终浓度为4 mmol/L、甜菜碱终浓度为1 mol/L的25μL体系下65℃反应90 min。对扩增终产物进一步进行酶切分析得到的条带大小与预期的结果(84和135 bp)吻合,以星状病毒、轮状病毒及诺如病毒为模板进行特异性测试亦没有发生交叉反应说明其特异性较好。分别用LAMP及PCR方法检测等倍稀释后的星状病毒质粒,灵敏度达到5.04 copies/μL和5.04×10copies/μL,比PCR高出10倍. 2、轮状病毒LAMP最佳反应条件为:镁离子终浓度为3 mmol/L、甜菜碱终浓度为1 mol/L的25μL体系下65℃反应90 min。对扩增终产物进一步进行酶切分析得到的条带大小与预期的结果(280bp、193bp和78bp)吻合,以轮状病毒、星状病毒及诺如病毒为模板进行特异性测试亦没有发生交叉反应说明其特异性较好。分别用LAMP及PCR方法检测等倍稀释后的轮状病毒质粒,灵敏度达到5.08copies/μL和5.08×102copies/μL,比PCR高出100倍。 3、诺如状病毒LAMP最佳反应条件为:镁离子终浓度为4mmol/L、甜菜碱终浓度为10mmol/L的25μL体系下63℃反应90 min。对扩增终产物进一步进行酶切分析得到的条带大小与预期的结果(179bp,239bp和299bp)吻合,以诺如病毒、星状病毒及轮状病毒为模板进行特异性测试亦没有发生交叉反应说明其特异性较好。分别用LAMP及PCR方法检测等倍稀释后的诺如病毒质粒,灵敏度达到2.168copies/μL和2.168×102copies/μL,比PCR高出100倍。 4、将改良后的RT-LAMP方法用于检测水环境中三种典型肠病毒,检出率分别为:饮用水(星状病毒未检出、轮状病毒16.7%、诺如病毒16.7%);再生水(星状病毒41.7%、轮状病毒25%、诺如病毒16.7%) 验结果表明,LAMP检测方法是一种检测程序简单、灵敏度和特异性较高的检测手段,在肠病毒的快速检测方面具有一定的开发潜力。


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