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灰葡萄孢菌菌株CanBc-1生物学特性及其致病力衰退机制研究

张蕾  
【摘要】:本文研究了灰葡萄孢菌弱毒菌株CanBc-1的生物学特性、致病力衰退相关RNA病毒(Botrytis cinerea debilitation related RNA virus,简称BcDRV)的基因组结构及其分类属性、致病力衰退的分子机理。最后还以弱毒将菌株CanBc-1及其恢复致病力的单分生孢子后代CanBc-1c-66为材料,初步分析了菌株CanBc-1中差异表达的基因。取得了如下研究结果: 首先,对源于6个地区和14种寄主植物的23个灰葡萄孢菌菌株进行了生物学特性分析。鉴定出一个异常菌株CanBc-1,其生长缓慢、菌丝异常分枝、仅产生少量分生孢子和菌核、完全丧失了致病能力。在菌株CanBc-1菌丝中检测到一种3.0 kb大小的dsRNA分子。通过对菌株CanBc-1单分生孢子后代的致病力,发现该菌株单分生孢子后代的致病力发生分化,有强毒后代出现。通过对不同类型杀菌剂的抗性测定,发现弱毒菌株CanBc-1对多菌灵、菌核净、农利灵等具有抗性。 其次,对灰葡萄孢菌弱毒菌株CanBc-1中的致病力衰退相关RNA病毒(Botrytis cinerea-debilitation related RNA virus,缩写为BcDRV)基因组的分子生物学特性进行了研究。通过cDNA克隆和RT-PCR技术获得了BcDRV基因组的全长序列,共2806 bp,GC含量为33.3%。通过与网上已知序列的分析比对,确定CanBc-1中的dsRNA分子是一个线粒体病毒,属于裸露病毒科(Narnaviridae)、线粒体病毒属(Mitovirus)。此外,还对灰葡萄孢菌菌丝的超微结构进行了透射电镜观察,发现弱毒菌株CanBc-1菌丝线粒体出现异常,包括皱缩、溃解、内部没有瘠等特征。可见,BcDRV可能以灰葡萄孢菌的线粒体作为攻击目标。 再次,对灰葡萄孢菌弱毒菌株CanBc-1的致病力衰退机制进行了研究。通过对不同灰葡萄孢菌菌株的侵染结构、果胶酶、植物毒素次生代谢产物、酸类物质和漆酶等致病相关因子的研究,发现弱毒菌株CanBc-1能够正常的分泌果胶酶、漆酶和植物性毒素物质,RT-PCR结果也证实弱毒菌株CanBc-1的果胶酶基因(Bcpg1-6)、漆酶基因(Bclcc1,Bclcc2)和毒素合成相关基因(Bcbot1)均能正常表达;但是通过对侵染结构的观察,发现弱毒菌株CanBc-1的菌丝顶端不能正常的形成侵染结构。因此,导致弱毒菌株CanBc-1致病力衰退机理包括:菌丝线粒体发生畸变,菌丝顶端不能正常产生侵染垫结构。 最后,对弱毒菌株CanBc-1和强毒菌株CanBc-1c-66(可视为菌株CanBc-1的近等基因系)在转录水平上的差异表达基因进行了分析。采用基因表达谱分析的方法,共得到了2288个差异表达的基因。在弱毒菌株CanBc-1中,1392个基因上调表达,896个基因下调表达。根据KEGG基因功能分类,表明差异表达的基因的功能涉及到糖类代谢(8%)、脂质代谢(5%)、核苷代谢(2%)、氨基酸代谢(4%)、多糖的生物合成与代谢(1%)、辅助因子和维生素代谢(2%)、能量代谢(3%)、聚酮化合物和萜类化合物的生物合成(1%)、外源物质的生物降解(1%)、酶类家族(10%)、转录(2%)、翻译(2%)、聚集和降解(2%)、复制和修复(2%)、膜运输(5%)、信号转导(1%)、配体受体的相互作用(3%)、细胞内加工处理(3%)和未分类蛋白(43%)等19类。其中,可能与灰葡萄孢菌和其它病原菌致病过程相关的差异表达基因有12个。上述结果为进一步挖掘灰葡萄孢菌致病相关基因奠定了基础。


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