收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

柑橘转GFP、AP1和LFY基因植株群体的分子鉴定与基因表达研究

范净  
【摘要】:转基因技术应用于改良农作物的特定性状,如耐除草剂、抗病性、抗虫性、抗环境胁迫、提高产量、改善品质等。还可以通过转基因植株超量或抑制特定基因的表达进行目的基因的功能验证。转基因植株能否广泛应用,其关键在于所转基因能否在遗传转化体内稳定整合和表达。本研究以转GFP、AP1、LFY柑橘为材料,分析外源基因的拷贝数、T-DNA整合、甲基化和外源基因表达之间的相关性;采用Real-time PCR在转基因桠柑中筛选单拷贝的转基因植株,以验证Real-time PCR在拷贝数分析上的可行性;分析转AP1和LFY柑橘的外源基因拷贝数和表达,研究早花转基因植株外源AP1或LFY及内源开花基因的表达。主要结果如下: 1. Southern杂交分析118棵转基因植株外源基因的拷贝数。结果表明大部分转基因植株拷贝数为1-2个。转GFP基因8株冰糖橙中5株为多拷贝(拷贝数大于3),转AP1桠柑(43株)有超过一半植株为多拷贝;转GFP佛罗斯特脐橙、转AP1茶枝柑、转LFY改良橙与尾张有性杂种、转LFY冰糖橙的拷贝数均为1-2个;转GFP改良橙与尾张有性杂种和转AP1金柑各有一个株系为多拷贝,其它为1-2个拷贝。不同转基因柑橘株系中都有T-DNA整合缺失的出现,转AP1茶枝柑、转LFY冰糖橙各有一个株系的GUS基因缺失。 2.转GFP柑橘荧光检测。转GFP基因佛罗斯特脐橙愈伤荧光稳定表达,在愈伤分化旺盛时绿色荧光表达较强。转GFP植株叶片荧光检测发现大部分转基因植株荧光正常表达,嫩叶荧光比老叶强;改良橙与尾张有性杂种有一个转基因株系荧光未检测到,即发生转基因沉默;一个株系的转基因冰糖橙荧光呈现斑驳化。 3. Southern杂交和反向PCR分析转GFP柑橘的T-DNA整合情况。详细分析3个转GFP改良橙与尾张有性杂种株系,6个转GFP冰糖橙的T-DNA整合:在6棵多拷贝的转GFP植株中,4棵植株中有T-DNA正向重复的排列;3株转基因冰糖橙都有一个T-DNA正向重复,1株转基因沉默的改良橙与尾张有性杂种中发现至少两个T-DNA重复;进一步测序发现T-DNA重复的左右边界序列都有不同程度的缺失,而转基因的改良橙与尾张有性杂种的两个T-DNA重复中存在一个500 bp片段的缺失,缺失部分为Mos-pro和部分nptII序列。 4.亚硫酸氢盐测序法分析转GFP柑橘的nptⅡ、GFP和CaMV35S启动子的甲基化程度。结果显示1-2个拷贝的转GFP柑橘外源基因和35S甲基化和质粒DNA甲基化程度类似;多拷贝转基因改良橙与尾张有性杂种其nptII序列有10%-20%的胞嘧啶甲基化,而该转基因植株的GFP和35S中胞嘧啶甲基化程度高达70%-90%,特别是CG和CNG类型的对称式的甲基化程度为90%。多拷贝转基因冰糖橙nptlI,GFP和CaMV 35S启动子序列的甲基化分别为10%-40%,20%-60%和60%-80%。 5.转基因柑橘外源基因表达。Northern杂交和Real-time RT-PCR分析nptII和GFP基因的表达,不同拷贝之间nptII表达没有差异,GFP在大多数多拷贝植株表达较低,转基因沉默植株GFP表达非常低;转LFY的改良橙与尾张有性杂种和冰糖橙的外源基因表达与拷贝数也没有相关性。 6.Real-time PCR在转AP1桠柑中筛选单拷贝植株。Real-time PCR分析结果表明43个转基因桠柑中有11株单拷贝,与Southern结果一致。Real-time PCR法检测的相对拷贝数与Southern杂交结果的相关系数分别为:AP1,0.7521;GUS,0.5856;nptlI,0.8222。 7.转AP1或LFY柑橘开花情况。5株转AP1金柑植株中1株移栽温室11个月开花(段艳欣,2006),在随后两年均正常开花;另有2株第二年开花,随后一年也正常开花;第三年,一个转基因株系表现为比对照植株晚花,其它转化或未转化植株均开花。3个转LFY的改良橙与尾张有性杂种2个株系早花移栽温室一年后开花;8个转LFY冰糖橙1株早花移栽温室两年后开花;其它转化和未转化植株都没开花。 8.外源开花基因和内源开花基因的表达。转AP1金柑的不同开花植株中外源AP1表达各有差异,部分开花植株的内源CiLFY上调表达,而内源CiAP1在开花植株中下调表达。在转LFY的冰糖橙和改良橙与尾张有性杂种中,早花植株的外源LFY表达相对较高,大部分转基因植株表现为内源CiAP1上调表达和CiLFY下调表达。早花转基因金柑可能与CiFT、CiLFY的上调表达和CiTFL1的下调表达有关,晚花与CiAP1和CiTFL1上调表达和CiFT的下调表达相关。转LFY的冰糖橙和改良橙与尾张有性杂种的早花转基因株系都表现为CiFT、CiWUS和CiTFL1下调表达。其它内源开花基因在转基因植株间没有规律性的变化。以上结果表明CiTFL1下调表达在调控转AP1或LFY柑橘开花时间上起着决定性的作用。 本文还对外源基因拷贝数、T-DNA重复、启动子与外源基因甲基化对外源基因表达的影响,Real-time PCR分析拷贝数的可行性以及外源AP1和LFY与内源开花基因在调控花期中的相互作用进行了讨论。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 王承赋;;影响柑橘流蜜的因素[J];中国蜂业;2008年11期
2 杨光明;;湘西地区柑橘花期蜂群的管理[J];蜜蜂杂志;2006年03期
3 邓锡刚;;石阡县柑橘生产与气候条件分析[J];耕作与栽培;1985年06期
4 付春华,郭文武,邓秀新;柚类、橘类叶肉原生质体分离方法研究[J];华中农业大学学报;2005年05期
5 谢雪芳;;柑橘秋季建园技术[J];果农之友;2008年10期
6 蒋自珍;袁亦文;孟幼青;郑京相;章丽华;王海英;;不同柑橘品种对柑橘黄龙病抗性试验[J];中国植保导刊;2006年09期
7 李健;杨昌鹏;;柑橘遗传转化育种研究进展[J];安徽农业科学;2010年03期
8 金国强;;临海市柑橘产业现状及发展方向[J];浙江柑橘;2010年02期
9 张海彬;鲜小红;黄昀;程光辉;李学琼;胡良杰;;柑橘标准化生产推进模式研究[J];农产品质量与安全;2011年03期
10 孟幼青;董海涛;严铁;赵琳;林云彪;袁亦文;佣志勇;;浙江不同品种柑橘黄龙病发生初报[J];浙江农业科学;2006年05期
11 ;柑橘品种巧辨别[J];农产品市场周刊;2006年44期
12 唐小浪;马培恰;吴文;黄永敬;麦国荣;;杂交柑橘品种——天草橘橙[J];果农之友;2007年11期
13 郑传良;;新优名果—“象山红”[J];宁波农业科技;2008年01期
14 刘建芳;祁春节;;我国柑橘品牌建设与管理研究报告[J];湖北农业科学;2010年02期
15 王子成;李忠爱;;成熟果实未发育胚珠培养获得三倍体柑橘[J];河南大学学报(自然科学版);2007年02期
16 唐小浪;曾莲;陈杰忠;马培恰;吴文;黄永敬;;广东省柑橘生产现状及发展对策[J];浙江柑桔;2007年02期
17 黄永敬;唐小浪;马培恰;吴文;戴宏芬;;几个柑橘品种叶片光合特性比较研究[J];中国农学通报;2008年12期
18 王彩霞;;柑橘成年态茎段培养技术体系研究[J];广东农业科学;2009年01期
19 王彩霞;;植物生长调节剂对3个柑橘品种形态建成的影响[J];中国农学通报;2009年02期
20 张昌记;陈聪;许基全;;柑橘——亚热带沿海盐碱地的高效经济林[J];中国林业;2009年11期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 曾莲;唐小浪;;广东省柑橘优势产业布局研究[A];科技与创新——广东园艺科技论文集(广东省园艺学会第九次会员大会暨学术研讨会论文集)[C];2010年
2 梁植荣;刘山水;;娄底市2008年柑橘受冻分析与防御对策[A];园艺学文集5[C];2010年
3 林羡;徐玉娟;吴继军;陈于陇;温靖;;四种广东柑橘果肉的糖酸组成研究[A];“食品加工与安全”学术研讨会暨2010年广东省食品学会年会论文集[C];2010年
4 刘雅丽;裴强;吴小璠;刘怀;;不同品种柑橘对黑刺粉虱体内主要水解酶活力的影响[A];粮食安全与植保科技创新[C];2009年
5 李光卫;;对永州柑橘发展的思考[A];中国柑橘科技创新与产业发展战略论坛暨中国柑橘学会2007年年会论文集[C];2007年
6 王平;唐小浪;马培恰;陈杰忠;吴文;黄永敬;;辐射诱变、芽变柑橘品种(系)的AFLP分析[A];庆祝中国园艺学会创建80周年暨第11次全国会员代表大会论文摘要集[C];2009年
7 邓子牛;;柑橘种质创新与品种改良策略[A];中国柑橘科技创新与产业发展战略论坛暨中国柑橘学会2007年年会论文集[C];2007年
8 段艳欣;李鼎立;邓秀新;郭文武;;柑橘胚性愈伤组织的褐化与转化[A];2008园艺学进展(第八辑)——中国园艺学会第八届青年学术讨论会暨现代园艺论坛论文集[C];2008年
9 赵岚岚;刘映红;江腾;;四种柑橘果实对桔小实蝇产卵和生长发育的影响[A];植物保护科技创新与发展——中国植物保护学会2008年学术年会论文集[C];2008年
10 叶春秀;牛建新;;新疆核桃LFY同源基因的克隆与特征分析[A];中国园艺学会2011年学术年会论文摘要集[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 范净;柑橘转GFP、AP1和LFY基因植株群体的分子鉴定与基因表达研究[D];华中农业大学;2010年
2 阮氏雪(NGUYEN THI TUYET);柑橘花粉染色体加倍与越南柑橘三倍体育种的研究[D];南京林业大学;2011年
3 林清山;柑橘林碳汇潜力和生态服务价值研究[D];福建农林大学;2010年
4 何利刚;柑橘CBF类似基因低温胁迫下的表达与分析[D];华中农业大学;2010年
5 温明霞;重庆柑橘钙素营养及调控研究[D];西南大学;2012年
6 谢深喜;水分胁迫下柑橘超微结构及生理特性研究[D];湖南农业大学;2006年
7 何富强;核桃LFY同源基因的克隆和表达[D];河北农业大学;2011年
8 张敏;柑橘果实扇形嵌合体的分离及两组嫁接嵌合体的遗传研究[D];华中农业大学;2006年
9 谢玉明;柑橘遗传转化体系的建立及chit42和phyB基因的导入[D];湖南农业大学;2007年
10 赵智中;柑橘果实糖积累的生理基础研究[D];浙江大学;2001年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 胡青波;柑橘种质资源抗溃疡病评价[D];湖南农业大学;2010年
2 魏召新;柑橘单核苷酸多态性分子标记的筛选及其在遗传多样性研究中的应用[D];西南大学;2010年
3 韩冰;柑橘间作生态系统的生理生态特性及效益分析[D];西南大学;2011年
4 曹雄军;泸红柑橘生物学性状研究与分子标记分析[D];湖南农业大学;2010年
5 刘绍俊;广西柑橘新优品种抗寒性研究[D];广西师范大学;2011年
6 申燕;三种柑橘品种对镁缺乏的响应及其生理机制研究[D];安徽师范大学;2011年
7 刘雅丽;黑刺粉虱自然种群动态及不同柑橘品种对其的影响初探[D];西南大学;2010年
8 施维属;福建柑橘种质资源ISSR分子评价[D];福建农林大学;2010年
9 李创;荷花LFY、AP1基因片段的克隆与分析[D];河南农业大学;2010年
10 郭丽英;广西扁柑及部分地方柑橘种质资源调查和亲缘关系分析[D];广西大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 沈德春 讲述 记者 陈江整理;远教架起致富桥[N];恩施日报;2011年
2 本报通讯员 邓珍辉 覃道武 王燕燕;外销柑橘5000多吨[N];张家界日报;2011年
3 记者 张海滨 通讯员 朱惠刚;五柳村橘农尝到了品种改良的甜头[N];金华日报;2011年
4 本报记者 刘辉霞 雷莉云;不同生态区域应选用适宜的品种[N];湖南科技报;2009年
5 铁铮;柑橘品种结构调整有科技支撑[N];中国绿色时报;2003年
6 记者 胡稳;首届柑橘品鉴会甜蜜举行[N];常德日报;2010年
7 记者刘志强;贵州柑橘品种结构将全面优化[N];科技日报;2002年
8 ;重庆柑橘五月鲜[N];农民日报;2011年
9 杨贞凤 瞿水湘;古丈县 全力搞活柑橘销售工作[N];团结报;2010年
10 实习生 李莹冰 记者  张茧 通讯员  李苗;湖南柑橘品种有望提质[N];湖南日报;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978