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鲤春病毒血症病毒单克隆抗体的制备及其免疫学检测方法的建立

张朋  
【摘要】:以纯化的鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus, SVCV)为抗原,免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、筛选,制备出了特异性单克隆抗体,分析了SVCV特异性单克隆抗体的免疫生物学特性,并建立了双抗体夹心ELISA方法用于检测SVCV。主要试验结果如下: 1.SVCV接种于敏感细胞系EPC增殖,待出现大量细胞病变时反复冻融数次并收集细胞悬液。蔗糖密度梯度离心纯化细胞悬液中SVCV。以纯化的SVCV为抗原,免疫BALB/c小鼠,100μg/只。小鼠首次免疫采用抗原与弗氏完全佐剂等量乳化,第二、三、四、五次免疫抗原与弗氏不完全佐剂等量乳化。第六次加强免疫不加佐剂。加强免疫后3天取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,37℃5%二氧化碳培养箱中培养。根据SVCV在蔗糖中的浮密度,选择60%、45%、30%三个浓度纯化病毒。经离心共收集到3个蛋白条带,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示病毒主要集中于第2个蛋白条带。本试验小鼠共免疫6次,最后1次免疫7d后,小鼠断尾采血,采用间接ELISA检测抗体效价,最高达1:2.7×105。取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0融合后培养,染色体计数分析细胞融合效果,融合率达到85%。 2.以纯化SVCV, EPC包被酶标板,未免疫小鼠血清、免疫小鼠血清分别作阴、阳性对照,PBS作空白对照。每孔加入待测培养上清,100μL/孔,37℃孵育1h后PBST洗涤3次;加入1:4000羊抗鼠酶标二抗(IgG-HRP) 100μL/孔,37℃孵育1h后PBST洗涤5次;底物(TMB)显色10min; 50μL 2 mol/L H2SO4终止,Spectra max Plus 384微孔板式连续光谱测度系统测定450 nm吸光值。有限稀释法对检测阳性孔进行克隆化。经筛选获得4株能稳定分泌抗SVCV单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为1F1、3E1、3F5、4F9。将4株杂交瘤细胞注射小鼠,制备腹水单克隆抗体。每种杂交瘤细胞株均收集到约10mL腹水。 3.辛酸-硫酸铵法纯化4种腹水单克隆抗体,SDS-PAGE分析纯化效果。纯化后4种单抗均有2条蛋白带,一条为IgG重链(约50 kDa),另一条为轻链(约25kDa)。纯化之前杂蛋白较多,而纯化之后杂蛋白明显减少,说明该纯化方法可有效去除大部分杂蛋白,可以用于单克隆抗体的纯化。经测定,SVCV腹水单克隆抗体ELISA效价为1:160 000-1:640 000,较杂交瘤细胞上清效价明显升高。亚型鉴定结果表明,这些单抗分属2个亚型(1F1、3E1, IgG2a; 3F5、4F9, IgG1),轻链均为K链。Western blot分析显示,单抗1F1、3F5、4F9能特异性地识别SVCV的N蛋白(47 kDa),3E1能特异性地识别SVCV的G蛋白(69 kDa)。采用相加ELISA法对抗原表位进行初步分析,结果显示,1F1、3F5、4F9可能识别相同的表位,3E1则可能识别不同的表位。间接免疫荧光试验结果显示4株单抗均能对染毒病灶产生特异性的荧光染色。这些单抗的成功制备为SVCV免疫学检测方法的建立奠定了基础。 4.以制备的鲤春病毒血症病毒(SVCV)单克隆抗体4F9和羊抗SVCV血清建立了SVCV双抗体夹心ELISA法。采用方阵滴定法确定了抗原、抗体的最佳反应浓度,并对ELISA各反应条件进行优化。结果显示:单抗最佳包被浓度为2.5μg/mL,最佳封闭液为2% BSA,37℃封闭1 h。羊抗血清最佳反应浓度为1:1000,HRP标记抗羊IgG最佳反应浓度为1:4000。同时本研究选择TMB作为底物,以无水乙醇作溶剂。试验结果表明底物最佳作用时间为室温反应10 min。该方法对SVCV检测灵敏度为40 ng/mL。特异性实验结果表明对KHV、HRV、VHSV、IHNV检测结果均为阴性,表明该方法特异性良好。


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