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J亚群禽白血病病毒gp85基因的克隆表达及初步应用

刘丽娜  
【摘要】:禽白血病(Avian leukosis, AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)引起的鸡的各种可传播的良性和恶性肿瘤。J亚群禽白血病病毒(ALV-J)是90年代初期分离并鉴定的一个新的亚群,其传播性和致病性都比其他亚群强,可引起鸡的髓细胞瘤,给全球养鸡业带来巨大的经济损失。近几年,国内部分省市出现大规模的禽白血病感染病例,主要以J亚群病毒感染为主。病毒的gp85基因是J亚群区别其它亚群的特异性序列。木研究利用原核表达系统表达ALV-Jgp85蛋白,建立J亚群禽白血病ELISA抗体检测方法,利用杂交瘤细胞融合技术制备抗gp85蛋白的单克隆抗体。为我国J亚群禽白血病的血清监测和抗原诊断试剂盒的开发奠定了基础。研究结果如下: (1)根据GeneBank中ALV-J的gp85基因序列设计针对J亚群病毒的特异性引物,以本实验室保存的ALV-J XT0908毒株为模板,用RT-PCR方法扩增目的片段,测序结果显示gp85基因片段与GeneBank中部分ALV-J核苷酸序列同源性在93.6%-98.2%。构建重组质粒pET-28a(+)-gp85,表达目的蛋白,使用His-镍亲和层析柱进行纯化。 (2)用gp85蛋白作为包被抗原,建立J亚群禽白血病ELISA抗体检测方法,并对该方法进行评价。结果表明该检测方法重复性良好,与禽源的几种病毒和细菌阳性血清均无交叉反应,并利用建立的ELISA抗体检测方法对临床血清样品进行检测,与IDEXX公司生产的抗体检测试剂盒符合率达到96.29%。。 (3)用gp85蛋白免疫Balb/C小鼠,将SP2/0骨髓瘤细胞和免疫脾细胞进行融合,阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆,并对杂交瘤细胞进行鉴定。将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔制备腹水。用辛酸-硫酸铵沉淀法对腹水进行纯化。结果表明,获得5株杂交瘤细胞:1G4、1B9、3A1、3D12、5G5。杂交瘤细胞上清抗体效价均在27以上,腹水抗体效价均在100×27以上,染色体数目均在79-93之间。Western-blotting鉴定结果表明,5株单克隆抗体均可以与gp85蛋白发生特异性反应。


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