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H1N1猪流感病毒与猪链球菌2型混合感染仔猪肺组织的基因表达谱分析

黄灿辉  
【摘要】:猪流感病毒(SIV)与猪链球菌2型(SS2)均为重要的呼吸道病原,两者混合感染所引起的猪呼吸道疾病综合征(PRDC)在临床中普遍存在,给养猪业造成了严重的经济损失。迄今为止,这两种病原的致病机制以及混合感染的协同致病机制仍不清楚,尚无有效的防治措施。本研究以仔猪为实验动物构建H1N1猪流感病毒与猪链球菌2型混合感染模型,利用基因芯片揭示单独感染与混合感染后仔猪肺组织的基因表达谱,并对差异表达基因进行分析,旨在探讨单独感染与混合感染在致病机制上的异同,为疫情的防制进行有益探索。 1.仔猪H1N1猪流感病毒-猪链球菌2型混合感染模型建立 在人工感染试验中,12头经检测SIV病原与抗体阴性、SS2抗体阴性仔猪随机分为4组,每组3头。实验第1天,SIV组和SIV-SS2组的仔猪鼻腔接种H1N1病毒液,同时空白对照组和SS2组使用DMEM进行相同处理。实验第4天,各组仔猪经2%冰醋酸溶液滴鼻处理30分钟后,SS2组和SIUSS2组的仔猪鼻腔接种SS2细菌液,同时空白对照组和SIV组使用PBS进行相同处理。实验第6天,解剖各组仔猪观察脏器病变、采集样品(提取总RNA、分离鉴定病原、制作病理切片)。自实验开始,每天监测仔猪的体温、临床表现,隔天采集鼻拭子。研究结果显示:相对于单独感染,H1N1猪流感病毒与猪链球菌2型混合感染可引起更严重的体温紊乱、更多样的临床症状,范围更广、程度更深的剖检病变和组织病变;同时猪链球菌2型可能有助于H1N1猪流感病毒的增殖,使猪流感的感染症状持续更长的时间。 2.仔猪H1N1猪流感病毒-猪链球菌2型混合感染基因表达谱分析 利用从上述模型构建中采集的各组肺脏样品,抽提总RNA,经纯化、反转录、标记后与Agilent4x44K Porcine Oligo Microarray杂交。芯片原始数据经扣本底和归一化处理后,采用一维方差分析法(one way ANOVA)对组间差异进行统计学分析,以组间差异倍数(Fc)≥1.5,且q-value0.05为标准筛选差异表达探针。结果显示:SIV组、SS2组、SIV-SS2组分别有1314、1354、2652个差异表达探针,对应444、411、844个差异表达基因。以Biological process为分类依据对各组差异表达基因进行Gene Ontology分析,结果显示SIV组、SS2组、SIV-SS2组的差异表达基因主要参与信号转导(signal transduction).转录(transcription).发育(development).免疫应答(immune response).细胞粘附(cell adhesion).炎性反应(inflammatory response).凋亡(apoptosis).天然免疫应答(innate immune response)等生物过程。以Kegg为数据库对各组差异表达基因进行pathway分析,结果显示SIV组、SS2组、SIV-SS2组的差异表达基因主要涉及细胞因子与细胞因子受体互作(Cytokine-cytokine receptor interaction).Toll样受体途径(Toll-like receptor signalingpathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、凋亡(Apoptosis)、补体途径(Complement and coagulation cascades)、细胞粘附分子(Cell adhesion molecules)、天然杀伤细胞介导的细胞毒作用(Natural killer cell mediated cytotoxicity)、造血(Hematopoietic cell lineage)等信号通路。通过对比、分析SIV组、SS2组、SIV-SS2组的基因表达谱,推测H1N1猪流感病毒与猪链球菌2型混合感染的致病机制至少包括以下两点:(1)混合感染可刺激宿主产生大量细胞因子,造成炎性细胞浸润,引起炎性病理损伤;(2)混合感染可诱导宿主细胞大量凋亡,引起肺脏机能障碍。


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