收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

鸡卵黄免疫球蛋白的分离纯化、mPEG修饰及其稳定性研究

王丽英  
【摘要】:鸡卵黄免疫球蛋白,简称IgY (chicken egg yolk immunoglobulin),又称鸡卵黄抗体,是由血液中IgG被选择性地转移到卵黄中唯一的免疫球蛋白类。由于IgY是蛋白质类大分子,具有一定的免疫原性,当其用于机体时,会引发抗体产生而降低疗效,并且易受温度、酸碱、酶的影响,从而限制了IgY的应用领域。本文针对这一问题,制备了mPEG化IgY,主要研究内容为:鸡IgY分离纯化,nPEG化学修饰,以及修饰前后的IgY稳定性进行对比研究。研究结果如下: 1.建立了一种高效、经济、大规模分离纯化鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)的生产方法,即在对传统水稀释法改良的基础上,结合聚乙二醇沉淀与离子交换色谱进行IgY的分离纯化。具体工艺为新鲜鸡蛋经过分离得到蛋黄液,经水稀释后,离心得上清液,向上清液中加入PEG6000沉淀蛋白,沉淀物经透析、冷冻干燥之后经过一步离子交换法进行纯化,并对具体工艺条件进行了优化。实验结果显示,用8倍无菌水稀释蛋黄液,用0.1mol/L HCl调节pH为5.2,在4℃下静置8h,于5000×g力离心可得上清粗IgY,经测定回收率可达93.47%。然后用6%聚乙二醇沉淀后经DEAE-Toyopearl650M离子交换纯化,最佳的纯化条件:0.05mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH7)平衡上样,0.075mol/L PBS (pH7)洗脱。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果显示所得的IgY的纯度为95%,活性保持率高达73.77%。本研究弥补了传统分离方法不能同时达到高纯度和高回收率的缺点,且可用于大规模生产。 2.研究了单甲氧基聚乙二醇(mPEG)对鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)的化学修饰,并通过傅里叶变换红外光谱、圆二色光谱和荧光光谱分析比较了修饰前后IgY的稳定性。具体修饰方法为:mPEG经NHS活化,得NHS-mPEG,冷冻干燥,NHS-mPEG对IgY进行化学修饰,得iPEG-IgY。 mPEG对IgY进行修饰过程中,通过对各种修饰条件的摸索和比较优化,最后筛选出mPEG最佳修饰反应条件为:IgY与活化后的nPEG按摩尔比1:10,pH7条件下反应1h可得修饰率为20.56%的mPEG-IgY,IgY活性保持率可达90%。修饰前的IgY二级结构中a-Helix、β-sheet、β-Turn、Random分别为14.5%、42.1%、6.2%、37.2%;修饰后的mPEG-IgY各二级结构含量分别为9.1%、44.9%、7.4%、38.6%。与修饰前相比,nPEG-IgY的α-螺旋含量降低了约37%,p-螺旋含量升高,其他含量变化不明显。 3.通过光谱分析法对IgY以及mPEG-IgY的热稳定性进行了研究。结果显示,70℃温育120min后,IgY的α-Helix、β-sheet、β-Turn、Random各二级结构含量由14.5%、42.1%、6.2%、37.2%变为1.6%、55.25%、5.8%、37.5%;mPEG-IgY的各二级结构含量由12.9%、42.7%、6.3%、38.1%变为3.1%、50.5%、7.2%、39.2%。热动力学分析表明,IgY热变性反应级数为1级,在65、70、75、80、85、90℃加热条件下,D值分别为:166.67、37.59、6.48、2.92、1.79、1.13min;此温度范围内的Z值为11.5℃,表观活化能Ea=200.841kJ/mol,焓值分别为198.0296、197.988、197.9465、197.9049、197.8633、197.8218kJ/mol,熵值分别为58.66751、58.65283、58.63837、58.62411、58.59619kJ/(mol·K),吉普斯自由能分别为33.09298、30.65444、28.2166、25.77931、23.34261、20.90646kJ/mo。 mPEG-IgY热变性反应级数为1级,在65、70、75、80、85、90℃加热条件下,D值分别为:208.33、60.61、8.02、4.48、2.50、2.18min;此温度范围内的Z值为12.22℃,表观活化能Ea=186.915kJ/mol,焓值分别为84.1036、184.0621、184.0205、183.9789、183.9373、183.5958kJ/mol,熵值分别为53.50651、53.49183、53.47737、53.62411、58.61005、58.59619kJ/(mol·K),吉普斯自由能分别为33.67654、31.45257、29.2292、27.00644、24.78425、22.26271kJ/mol。 4.对IgY以及mPEG-IgY不同酸碱条件下的稳定性进行了研究。结果显示,在4h、pH11条件下:nPEG-IgY活性保持率比IgY活性保持率高接近五倍。圆二色光谱扫描分析显示,在pH4处理条件下,IgY的α螺旋含量降低了76.4%,而修饰后的IgY降幅减少15.7%;IgY以及mPEG-IgY的β折叠含量均有所增高,增幅分别为18.4%和29.7%。在pH11条件下圆二色光谱扫描结果为IgY的α螺旋含量降低了71.1%,而修饰后的IgY降幅减少14.9%;IgY以及mPEG-IgY的β折叠含量均有所增高,增幅分别为16.5%和21.7%。说明IgY经过mPEG修饰以后所得产物对酸碱有着更高的耐受力。 5.对IgY以及nPEG-IgY在模拟胃肠液消化系统中的稳定性进行了研究。结果显示,在pH4的模拟胃液消化过程中,反应30~45min时间段内,IgY活性保持率由83.57%变为55.59%,活性降低28.08%;mPEG-IgY活性保持率由89.81%变为72.63%,活性降低17.18%。反应90~120min时间段内,IgY活性保持率由46.24%变为31.33%,活性降低14.91%;mPEG-IgY活性保持率由63.21%变为60.44%,活性降低2.77%。pH2条件下,对比IgY以及mPEG-IgY活性保持率可以发现,反应30~45min时间段内,IgY活性保持率由71.69%变为50.37%,活性降低21.32%;mPEG-IgY活性保持率由83.33%变为65.25%,活性降低18.08%。反应90~120min时间段内,IgY活性保持率由41.36%变为20.69%,活性降低20.67%;mPEG-IgY活性保持率由55.49%变为49.82%,活性降低5.67%。氨基酸成分分析结果显示,修饰前以及修饰后的IgY,氨基酸成分以及含量基本一致,说明IgY在经过nPEG修饰之后一级结构并没有被破坏。寡肽成分分析结果表明,经消化液酶解后,mPEG-IgY寡肽的种类和数量减少,说明经IgY过修饰后比修饰前有着更强的胃蛋白酶、胰蛋白酶稳定性。因此可知经过修饰后的IgY比没有修饰的天然IgY有着更强的胃蛋白酶、胰蛋白酶稳定性。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 张印则,赵锋,单小燕,李伟,兰炯采,章扬培,张志欣;温度对mPEG-BTC修饰HLA抗原效果的影响[J];中国输血杂志;2004年05期
2 王捷熙,檀英霞,李立立,白燕,章扬培;甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰遮蔽人ABO血型抗原[J];中国生物化学与分子生物学报;2004年05期
3 邱艳,章扬培;红细胞血型抗原化学修饰的研究进展[J];军事医学科学院院刊;2004年05期
4 张印则,李伟,周华友,兰炯采,章扬培,张志新;mPEG-BTC对淋巴细胞表面HLA-A2抗原化学修饰效果评价[J];中国输血杂志;2004年05期
5 檀英霞,王捷熙,李立立,章扬培;化学材料修饰红细胞非ABO系统血型抗原的研究[J];中国输血杂志;2004年02期
6 张印则,周华友,李伟,兰炯采,章扬培,张志欣;mPEG-BTC对血小板表面HLA抗原的化学修饰[J];细胞与分子免疫学杂志;2004年01期
7 张印则,李伟,周华友,单小燕,兰炯采,章扬培,张志新;mPEG修饰淋巴细胞HLA-A_2抗原的研究[J];第一军医大学学报;2003年06期
8 檀英霞,王捷熙,章扬培;体外化学修饰红细胞——通用型血?[J];生命科学;2004年01期
9 卞丽红,梅兴国,章扬培;新一代PEG在修饰抗原和药物缓释中的应用[J];生命科学;2004年05期
10 母敬郁,孙立群,张培因,麦荫乔,董甲有;应用活化mPEG5000修饰HCG及其活性研究[J];中国生物制品学杂志;1995年02期
11 王捷熙,刘泽澎,曹琼,周华勇,兰炯采,章扬培;甲氧基聚乙二醇遮蔽猕猴红细胞表面类人B抗原的研究[J];中国输血杂志;2003年04期
12 徐华,李立立,檀英霞,章扬培;甲氧基聚乙二醇修饰几种红细胞稀有血型抗原的初步研究[J];军事医学科学院院刊;2004年02期
13 王金宏;改善蛋白药代动力学的方法──蛋白聚乙二醇化的研究进展[J];国外医学.药学分册;2003年05期
14 李立立,王捷熙,檀英霞,章扬培;甲氧基聚乙二醇修饰改造RhD(+)血型的初步研究[J];中国实验血液学杂志;2003年06期
15 张印则,李伟,单小燕,周华友,兰炯采,章扬培,张志欣;甲氧基聚乙二醇苯并三唑修饰对淋巴细胞功能的影响[J];中国药理学与毒理学杂志;2004年06期
16 徐静,倪道明,张振龙;聚乙二醇修饰β-干扰素的研究[J];微生物学免疫学进展;2004年03期
17 田兴华;MPEG的产生和发展[J];第四军医大学学报;2002年S1期
18 李伟,张印则,周华友,兰炯采,章扬培,张志欣;mPEG修饰HLA抗原的方法学研究[J];生命科学研究;2003年04期
19 徐华,李立立,章扬培;mPEG修饰解决血型匹配困难的体外研究[J];中国实验血液学杂志;2004年02期
20 龙卉;甲氧基聚乙二醇在肿瘤防治中的应用[J];国外医学.儿科学分册;2005年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 阮象华;;MPEG之旅——MPEG-1到MPEG-7[A];中国电子学会第七届学术年会论文集[C];2001年
2 刘崭;王蔚茹;高彦芳;谢续明;;梳状聚合物中侧链PEG的结晶行为的研究[A];2004年全国高分子材料科学与工程研讨会论文集[C];2004年
3 张全;袁艺;李素波;窦娜;季守平;熊砚芳;;mPEG修饰人脐血单个核细胞后干祖细胞在小鼠造血重建[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年
4 王溪波;牛连强;尹宝坤;;MPEG数据传输中丢包的实时修复算法[A];全国第16届计算机科学与技术应用(CACIS)学术会议论文集[C];2004年
5 刘崭;朴虎进;徐军;王震;谢续明;;端基对聚乙二醇单甲醚结晶行为的影响[A];2004年全国高分子材料科学与工程研讨会论文集[C];2004年
6 林琦;王丽娜;董晓梅;于戈;申德荣;;MPEG视频信息中的数字水印研究与实现[A];第十九届全国数据库学术会议论文集(技术报告篇)[C];2002年
7 成时亮;陈彦模;俞昊;;干法纺丝制备相变纤维及其性能研究[A];2007年全国高分子学术论文报告会论文摘要集(下册)[C];2007年
8 惠新标;董永强;戚丹青;;MPEG码流分析仪的软硬件实现[A];全国广播电影电视系统首届中青年优秀科技论文集[C];2001年
9 崔晓蓓;姚康;;基于MPEG视频流的文字检测与提取[A];第三届中国智能计算大会论文集[C];2009年
10 袁学东;游志胜;;一种微型嵌入式数字视频服务器[A];第十二届全国图象图形学学术会议论文集[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张印则;HLA抗原修饰方法学及通用血小板的研究[D];第一军医大学;2004年
2 檀英霞;红细胞的物理化学修饰[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
3 王捷熙;红细胞血型抗原的化学修饰[D];中国人民解放军军事医学科学院;2003年
4 翟英雷;聚乙二醇/聚酸酐共聚物的制备及药物控制释放性能研究[D];天津大学;2009年
5 刘芳芳;SPR传感检测细胞表面分子相互作用的方法研究[D];清华大学;2010年
6 杜婧;胰岛素降解酶表达调控机制及其在阿尔茨海默病中的应用[D];清华大学;2009年
7 鲁云霞;人PTP1B克隆表达及豹皮樟总黄酮治疗2型糖尿病大鼠部分机制的研究[D];安徽医科大学;2009年
8 张作法;桑枝活性成分分离纯化及其药理作用的研究[D];浙江大学;2008年
9 国狄非;数字高清晰度电视与多媒体相关技术研究[D];天津大学;2003年
10 毕淑云;药物与生物分子相互作用的光谱法研究[D];吉林大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王丽英;鸡卵黄免疫球蛋白的分离纯化、mPEG修饰及其稳定性研究[D];华中农业大学;2012年
2 李翔;AVD系统中基于MPEG的存储与压缩技术研究[D];西北工业大学;2001年
3 韩勇;MPEG压缩域中包含相机运动方式的镜头边界检测算法研究[D];山东大学;2010年
4 王立;TS流复用解复用及DSM-CC特技播放研究[D];天津大学;2004年
5 郝育闻;MP3解码器软件实现[D];大连理工大学;2000年
6 陈玉;MPEG音频数据编解码算法研究及DSP实现[D];西北工业大学;2002年
7 兰慧;基于ATJ2097的多媒体播放器的研究[D];华中师范大学;2008年
8 邱多;基于MPEG压缩域视频关键帧提取技术的研究[D];燕山大学;2011年
9 陈功;MPEG视频流转码技术的研究[D];北京工业大学;2003年
10 万伟;基于MPEG-2的视频监控与运动目标跟踪技术研究[D];华中师范大学;2005年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 山歌;基于MPEG技术的电视会议系统[N];计算机世界;2000年
2 李松林;电影合并——双叉戟[N];中国电脑教育报;2003年
3 河南 EVAer;在MPEG中加上“神秘水印”[N];电脑报;2004年
4 记者 郑千里;MPEG和JPEG将对信息产业发生深远影响[N];科技日报;2002年
5 黑龙江 孟秋君;在Premiere中快速输出MPEG影像[N];电脑报;2002年
6 重庆 甘露;在Linux中制作VCD[N];电脑报;2001年
7 张莎莎;巧用压缩软件合并MPEG文件[N];中国电脑教育报;2003年
8 ;多媒体世界[N];中国电脑教育报;2000年
9 湖南 头重脚轻;文件坏了不要急——修复攻略[N];电脑报;2004年
10 河南 EVAer;WMV格式,想怎么变就怎么变![N];电脑报;2004年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978