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蜂王浆的酶法修饰及其ACE抑制活性和抗氧化活性研究

陈静  
【摘要】:本论文以鲜蜂王浆为原料,用工业化生产的微生物来源的蛋白酶进行适度酶解修饰,并对其产物的组成、分子量大小以及氨基酸组成、序列和生理活性进行评价,探索酶法修饰产物的组成和结构与生理活性之间的关系,为进一步以易于获得的蛋白酶对蜂王浆进行酶法修饰生产高活性的蜂王浆产品提供一定的试验数据和理论指导。主要研究内容和试验结果如下: (1)蜂王浆酶法修饰用蛋白酶的选择:以抑制ACE(血管紧张素转换酶)活性为指标,在蜂王浆质量浓度为0.05g/mL(湿重)时,比较五种工业化生产的微生物来源蛋白酶酶法修饰产物和新鲜蜂王浆对ACE的抑制活性,结果表明新鲜蜂王浆对ACE的抑制率仅为6.45±0.84%,而5种蛋白酶酶法修饰产物皆有很强的抑制活性,其中天野蛋白酶P的酶法修饰产物的抑制ACE酶活性最强,其抑制率达到71.47±2.86%,因此选取天野蛋白酶P对蜂王浆进行适度酶法修饰,确定最佳的酶法修饰条件。 (2)酶法修饰工艺条件的优化:以酶解时间、蜂王浆质量浓度、蛋白酶添加量为单因素分别进行单因素试验,在单因素试验的基础上采用Box-Behnken二次旋转正交试验进行优化,通过响应面分析得到天野蛋白酶P最佳酶解修饰条件为:酶解时间196min、蜂王浆质量浓度0.0653g/mL(湿重),加酶量1503u/g。 (3)酶法修饰产物的分离条件优化:在天野蛋白酶P的最佳酶法修饰条件下对蜂王浆进行酶解修饰,其产物用葡聚糖凝胶G-25进行分离,最佳的洗脱条件为:lmol/L醋酸为流动相,上样量1.5mL,流速为0.8mL/min,共分离出三个色谱峰,收集各洗脱峰,浓缩冻干,分别命名为GFC-1、GFC-2和GFC-3。 (4)蜂王浆、酶解产物以及凝胶色谱分离各级分对ACE酶抑制活性的比较:新鲜蜂王浆几乎没有抑制ACE活性,而蜂王浆经过酶法修饰后的酶解产物对ACE抑制活性显著增强(P0.01)。当浓度为4.5mg/mL(干重)时,新鲜蜂王浆ACE抑制率仅为5.45±1.67%,蜂王浆经过天野蛋白酶P酶法修饰后的酶解产物的ACE抑制率达到48.19±1.98%,GFC-3的抑制率最高,达到72.75±2.12%。酶解产物及其经过凝胶色谱分离得到的各级分的ACE抑制活性存在明显差异,GFC-3的ACE抑制活性最强(P0.05),IC50为3.193mg/mL (5)酶解产物以及凝胶色谱分离各级分与蜂王浆抗氧化活性比较: ①硫代巴比妥酸法测定样品对脂质体系过氧化的抑制能力(%):在3.8mg/mL时,新鲜蜂王浆的抑制率仅为12.69±0.28%,酶解产物及各级分抑制率显著增强(P0.01),其中酶解产物的抑制率为64.7±1.16%,GFC-3的抑制率最高,达到74.73±2.25%。不同浓度条件下,GFC-3的抑制率最高(P0.01),其IC50为3.382mg/mLo ②邻苯三酚法测定样品对超氧阴离子的清除率(%):在2.4mg/mL时,新鲜蜂王浆的清除率仅为11.38±1.07%,酶解产物和各级分的清除率显著增加(P0.01),其中酶解产物清除率达到63.07±0.7%,GFC-3的清除率最高为72.38±0.68%。不同浓度条件下,GFC-3的清除率最高(P0.01),其IC50为1.626mg/mL。 ③Fenton体系法测定样品对羟自由基的清除率(%):在5.6mg/mL时,新鲜蜂王浆对羟自由基清除率仅为11.16±1.57%,酶解产物和各级分的清除率有了显著的增强(P0.01),其中酶解产物的清除率达到63.04±1.14%,GFC-3的清除率最高,为70.16±1.44%。不同浓度条件下,GFC-3的清除率最高(P0.01),其IC50为4mg/mL ④样品对Fe3+还原能力的比较:分别比较了新鲜蜂王浆、蜂王浆酶法修饰产物及其凝胶色谱分离产物对Fe3+还原能力。当浓度为9mg/mL时新鲜蜂王浆还原Fe3+为Fe2+能力值A700nm为0.127±0.008,酶解产物和各级分还原Fe3+为Fe2+能力显著增加(P0.01),酶解产物还原Fe3+为Fe2+能力值A700nm为0.63±0.009,GFC-3还原Fe3+为Fe2+能力最强,其A700nm达到0.74±0.006。不同浓度条件下,GFC-3还原能力最强(P0.01)。以A700nm为0.5时作为评价指标考察各成分的还原能力,GFC-3的浓度为7.126mg/mL。 (6)GFC-3的氨基酸组成分析及MALDI-TOF-MS分析表征:对活性最强的GFC-3进行氨基酸组成分析,发现其含有17种氨基酸,其中Asp, Glu, Lys, Val,Ser含量较多。通过MALDI-TOF-MS对GFC-3结构进行分析,一级质谱分析结果表明其质荷比(m/z)都在1400以下,m/z在800-1400之间共有8个峰;其中m/z为814.31的母离子可能的氨基酸序列为:Gln-Cys-Ser-Trp-Ser-Met; m/z为1311.43的母离子可能的氨基酸序列为:Asp-Cys-Cys-Gly-Tyr-Thr-Thr-Cys-Asp.


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