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土壤环境弓形虫与细菌污染的检测与修复

杜芬  
【摘要】:土壤生物污染是指一个或几个有害的生物种群从外界环境侵入土壤,引起土壤质量下降,不仅破坏了原有的生态平衡,还会对植物、动物、人类健康以及生态系统造成不良的影响。近年来,随着人感染禽流感、SARS、猪链球菌病、猪流感等突如其来的疫病灾害的发生,以及人民生活水平的不断提高和环境保护意识的逐渐增强,土壤环境的生物污染问题越来越受到大家的关注。 为此本研究选取弓形虫和粪便污染指示菌为代表,首先建立其检测方法,然后对土壤的污染情况进行调查,紧接着针对猪场土壤环境中大肠杆菌的污染情况,通过土壤载体试验、盆栽试验、现场模拟试验从化学消毒剂、生物消毒剂、复合型消毒剂中筛选几种可行的消毒剂,并从戊二醛对土壤微生态环境的影响和残留两个方面进行了戊二醛对土壤的安全性评价。 (1)土壤环境中弓形虫卵囊检测方法的建立和应用 建立了土壤环境中弓形虫卵囊的PCR/B1、PCR/529和LAMP/MIC3检测方法,检测极限分别为50、5和5个速殖子/0.5g土壤,特异性试验说明仅弓形虫RH株和Prugniaud株能扩增得到特异性目的条带。PCR/B1和PCR/529扩增均为阳性的样品判定为PCR阳性。用PCR和LAMP方法分别检测来自公园、猪场和校园的483份土壤样品,结果表明,两种方法分别得到81(16.77%)份和133(27.54%)份阳性样品,其中猪场土壤的污染最为严重。 武汉市6个公园的检测结果表明,所有的公园都受到了不同程度的污染(P0.05)。在12个被调查的猪场中,仅1个猫低密度猪场的土壤未受到污染,PCR和LAMP检测结果显示猫高密度猪场土壤阳性率分别为低密度猪场的2.24和2.21倍,表明猫的数量与土壤的污染情况呈正相关。公园和校园土壤污染的季节性分析显示,土壤全年受到弓形虫卵囊的污染,各季节之间差异极显著(P0.01),且从春天到冬天呈现逐渐下降的趋势。因此,土壤可能是人和动物感染弓形虫的传染源之一。另外,建立的PCR和LAMP方法能有效检测土壤中弓形虫卵囊。 (2)猪场土壤环境细菌性污染的调查 以细菌总数和粪便污染指示菌(大肠杆菌、大肠菌群)为指标,采集湖北省17个规模化猪场共86份土壤样品进行检测与计数,并评价了土壤的污染程度。采用的方法分别为:细菌总数—涂布牛肉膏蛋白胨平板培养;大肠杆菌—PCR方法和涂布麦康凯平板培养;大肠菌群—MPN法。结果显示,PCR方法检测所有土样均为大肠杆菌阳性,土壤中细菌总数、大肠杆菌和大肠菌群分别为4.5×104~6.9×107cfu/g、O~1.2×106cfu/g.1.2×104~5.3×107cfu/g.根据细菌总数判定有72.09%的土壤污染严重。根据大肠杆菌判定有41.86%的土壤被粪便污染严重,大肠菌群已超出我国畜禽养殖业污染物排放标准规定的10-10,000倍,表明土壤中有肠道致病菌存在且已严重超标。秋季土壤大肠杆菌污染最为严重,其次是春天、冬天和夏天。 (3)土壤中大肠杆菌消毒剂的筛选 本研究选取依绿笑(二氧化氯)、安必杀(有效碘)、戊二醛、申嗪霉素(M18)、天然净等五种消毒剂对土壤中大肠杆菌进行消毒效果评价,从而筛选最佳消毒剂。大肠杆菌稀释液的筛选试验结果表明,0.1%Tween80/PBS的分散性最好。化学消毒剂的中和剂鉴定试验表明,0.5%Na2S203+1%Tween80可有效中和200mg/L的二氧化氯,0.5%Na2S203+1%卵磷脂+1%Tween80可有效中和2000mg/L的有效碘,1%甘氨酸+1%卵磷脂+1%Tween80可有效中和2%的戊二醛。 土壤载体试验结果表明:2000mg/L有效碘作用30min,200mg/L二氧化氯作用2min或100mg/L作用1h,0.05%戊二醛作用15min或0.01%作用30min,100mg天然净添加于5g土壤中作用48h可完全杀灭土壤中大肠杆菌。但申嗪霉素对土壤中大肠杆菌和细菌总数均无影响。现场模拟试验结果表明:400mg/L二氧化氯作用24h或600mg/L二氧化氯作用12h,0.1%戊二醛作用12h可杀灭土壤中95%以上的大肠杆菌。 (4)戊二醛处理对土壤的安全性评价 戊二醛处理后,通过对土壤中可培养微生物进行平板计数,发现戊二醛对土壤中大肠杆菌作用明显,高浓度对细菌、真菌影响较小,但对放线菌影响较大,中、低浓度对细菌、真菌、放线菌的冲击小,且都能在一段时间内恢复正常水平。Biolog的结果显示,低浓度的戊二醛处理有轻微提高微生物活性的作用,中、高浓度处理则有抑制作用,但经过一段时间后微生物活性均能恢复正常。总而言之,虽然戊二醛处理对土壤中微生物对单一碳源的利用能力产生了影响,但各处理间无明显差异。另外,建立了土壤中戊二醛的高效液相色谱检测方法,戊二醛采用2,4-二硝基苯肼柱前衍生后检测,戊二醛在土壤中的最低检测限和最低定量限分别为0.01mg/kg和0.02mg/kg。土壤中戊二醛的消解测定结果表明,在第1d可消除70%及以上,第2d可消除97%以上。总之,戊二醛对土壤微生态环境的影响比较柔和,且不会因残留导致二次污染,是一种安全、高效的土壤生物污染消毒剂。


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