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水稻组织特异表达启动子的分离克隆、功能分析及应用

叶荣建  
【摘要】:高等植物的生长发育是不同基因在时间和空间上有序表达和协同作用的过程。启动子作为转录水平上一个重要的调控元件,通过和众多转录因子的结合进而决定了基因的表达模式与表达强度。深入研究启动子的结构、功能、作用模式等对于回答分子生物学中的一些基本理论问题具有重大意义。如何让外源基因在植物体内定向、高效、稳定的表达是植物基因工程研究的出发点和落脚点。用组织特异表达启动子来驱动目的基因表达可有效的避免用组成型表达启动子所带来的一些诸如代谢负担之类的负面效应。但是目前调控机理清楚且可用于作物遗传改良的组织特异表达启动子仍然较少。 水稻是非常重要的粮食作物之一,亦是功能基因组学研究的模式植物。本研究的目的就是从水稻中分离克隆组织器官特异表达启动子,分离鉴定起关键调控作用的顺式元件,为转基因水稻育种服务,为长远的启动子改造和设计储备资源。本研究获得的主要结果如下: 1.构建改造5个专门用于水稻启动子克隆及功能验证的载体:DX2181、DX2181S、DX2181G、DX2181Smini46和DX2181Smini89。 2.利用RT-PCR的办法对基于芯片数据挑选出的胚乳特异表达候选基因En2做进一步表达模式鉴定。分离克隆En2的启动子EnP2,将其与报告基因GUS融合,转基因结果证明EnP2为胚乳特异表达启动子。5’系列缺失证明,155bp的长度的启动子(EnP2-155)就足以维持胚乳特异表达模式。 3.利用RT-PCR的办法对基于芯片数据挑选出的胚乳特异表达候选基因En3做进一步表达模式鉴定。分离克隆En3的启动子EnP3,转基因结果证明EnP3为胚乳特异表达启动子。5’系列缺失证明,126bp长度的区域(从启动子EnP3-292到EnP3-166之间的区域)对于维持EnP3-292胚乳特异表达模式是至关重要的。突变分析发现顺式作用元件"2SSEEDPROTBANAPA"和"GCN4-like motif"以负向调控元件身份来对EnP3-292胚乳特异表达模式进行调控,但并不影响启动子在胚乳中的表达模式与强度。 4.利用RT-PCR的办法对基于芯片数据挑选出的绿色组织特异表达候选基因DXl做进一步表达模式鉴定。分离克隆DXl的启动子PDX1,转基因结果证明PSX1为绿色组织特异表达启动子。5’及3’系列缺失证明-195至-22和+1至+86这两个区域直接决定启动子PDXl的活性,凝胶阻滞实验在这两个区域分别鉴定出绿色组织特异表达顺式作用元件GSEl和GSE2。突变分析发现GSEl和GSE2都是作为正向调控元件来的行使功能的,GSEl可以同时调控所有绿色组织(叶片、叶鞘、茎杆和穗)基因的表达且影响作用较大,而GSE2只能调控叶鞘和茎杆这两个组织基因的表达且影响作用较微弱。 5.用根癌农杆菌Ti质粒介导的遗传转化法,将粳稻品种“日本晴”来源的rbcS基因启动子驱动下的cry1C*基因导入粳稻品种中花11,结合Southern blotting检测、纯合阳性株系筛选、田间抗性评价、农艺性状考察及CrylC*蛋白测定,最终从47株阳性单株中挑选出一个外源基因单拷贝整合、遗传稳定、田间抗性效果好、主要农艺性状无变化且Cry1C*蛋白在主要食用部位胚乳的含量极低的株系RJ5,该株系有很强的商业化潜力。


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