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猪链球菌2型fbps基因突变株的构建及其生物学特性的研究

夏静  
【摘要】:猪链球菌(Streptococcus suis, S. suis)是导致猪链球菌病主要的病原菌。该菌可分为33个血清型,其中猪链球菌2型(Streptococcus suis type2, SS2)致病性强、流行最广泛并且在临床上,该型是分离率最高的血清型之一。SS2可引起猪的脑膜炎、化脓性肺炎和心肌炎等疾病。SS2可通过直接感染特定从业相关人群,严重的病例发生中毒性休克综合症,导致多脏器衰竭及死亡,是一种重要的人畜共患病。近几年猪链球菌病的几次爆发流行,因此SS2成为了国内外广泛关注和研究的热点,尤其是关于其致病和免疫防治。 SS2对宿主的粘附过程可能是其致病过程中一个关键的步骤。SS2和宿主细胞的粘附并非一个简单的过程,在细菌和细胞表面都有多种相关因子参与了此过程,因此研究在此过程中发挥作用的关键因子可能会对SS2致病机理阐释发挥重要作用。 猪链球菌2型基因组中的fbps基因编码了一种具有纤连蛋白结合位点的表面膜蛋白(fibronectin binding proteins, FBPS),和它具有同源性的同样具有Fn结合活性的蛋白在其他链球菌的感染中发挥着关键的作用,因此推断,FBPS可能是猪链球菌感染的吸附过程中的一个重要的参与蛋白。 在此背景之下,我们以SS2高致病性菌株SC19作为亲本菌株,以纤连蛋白结合蛋白编码基因作为研究对象,构建了fbps基因的缺失突变株,并在此基础上分析fbps基因的缺失对SS2基本生物学性状以及对致病力的影响,主要研究内容包括: 1温敏型自杀性重组质粒的构建 以2005年四川分离的SS2高致病性菌株SC19为亲本菌株,分别扩增fbps基因的780bp上游序列和81bp的下游序列,并利用融合PCR的方法获得上下游同源臂全长片段并连接到pMDx-18T载体,构建克隆载体pMDx-18T-f,分别用EcoR1和BamH1同时酶切pMDx-18T-f和pSET4s载体后连接,构建自杀性重组转移质粒pSET4s-fbps。 2纤连蛋白结合蛋白fbps基因突变株的构建 将重组质粒pSET4s-fbps电转化亲本菌株SC19感受态细胞,以壮观霉素抗性标记和温度敏感双重筛选,得到fbps基因缺失突变菌株。并进一步通过PCR等方式对筛选出的突变菌株进行验证。 3纤连蛋白结合蛋白fbps基因突变株生物学性状的研究 在构建的fbps基因突变株的基础上,研究缺失菌株的遗传稳定性,体外生长和增殖的能力等生物学性状。结果表明,连续传代十代突变株均能稳定遗传。野生株和突变株的生长没有显著的差异,fbps基因的缺失不会影响SS2的生长和繁殖的速度。 4fbps对宿主的吸附侵入以及毒性作用 以Hep-2细胞为模型,对比研究fbps缺失菌株和SC19野生型菌株粘附能力和侵入能力,以培养液中LDH的渗出为参照,测定培养液中LDH含量,比较突变株和野生菌株对细胞毒性作用。结果表明,fbps基因缺失突变株对Hep-2细胞的粘附能力和亲本株SC19相比下降了78%;对细胞侵入能力下降23%;测定LDH的浓度发现fbps基因突变株比野生型的毒性降低了32%。 5突变株致病性研究 将野生型菌株SC19和fbps基因缺失突变株分别以107cfu/ml,108cfu/ml和109cfu/ml的剂量腹腔注射昆明鼠(1m1)。结果显示,注射突变株的死亡率远远低于注射野生型SC19菌株的试验组。不同时间点剖杀小鼠不同器官的细菌动态分布表明,缺失了fbps基因导致细菌的组织定植能力显著下降。病理组织学观察发现SS2fbps基因缺失突变株和野生型在小鼠中病变范围类似,主要引起肺部,脑部和心脏的病变,但是突变株引起的病变程度较轻微,说明fbps基因缺失突变株致病性显著降低。


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