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油菜缺磷诱导表达基因BnSPX3和BnIPS1及其启动子的分离与鉴定

杨广哲  
【摘要】:磷是植物生长发育必需的营养元素。由于土壤中磷很容易被吸附固定,所以土壤中磷的生物有效性很低,缺磷成为限制作物产量的重要因素。植物通过生理生化和形态发育的变化来应对缺磷胁迫,这些变化的产生涉及大量基因的诱导表达。目前已经在一些物种中分离鉴定了很多缺磷诱导表达基因。油菜是我国主要的油料作物,需磷较多,对缺磷敏感。为了探究甘蓝型油菜应对缺磷胁迫的分子反应和机制,我们分离了8个甘蓝型油菜缺磷诱导表达基因。对其中的SPX结构域基因BnSPX3和TPSI1/Mt4家族基因BnIPS1及其启动子进行了深入研究。主要结果如下: 1.利用拟南芥的基因信息,通过同源序列法从甘蓝型油菜中分离了8个缺磷诱导表达基因,它们包括磷酸酶、硫脂合酶、单半乳糖甘油二脂合酶、SPX和TPSI1/Mt4家族基因以及功能未知基因。 2. BnSPX3在甘蓝型油菜中至少包括两个同源基因,BnSPX3;1和BnSPX3;2。二者的cDNA全长分别是936和863bp,具有95%的核苷酸相似性;二者具有相同的基因结构:三个外显子和两个内含子;二者的开放读码框(ORF)分别长741和720bp,编码246和239个氨基酸的蛋白质,这两个蛋白质只含有SPX保守结构域。进化分析表明BnSPX3;1和BnSPX3;2分别来自白菜和甘蓝基因组,并且二者的序列分化要早于甘蓝型油菜的形成。基因表达分析显示BnSPX3;1和BnSPX3;2受缺磷特异诱导表达,并且诱导具有持续性和可逆性。 3.通过同源序列法分离了BnSPX3;1和BnSPX3;2的启动子,分别位于转录起始位点上游1742和1874bp。两个启动子除了含有TATA box和Y Patch等核心启动子元件外,还含有P1BS口PHO等参与缺磷诱导表达基因调控的顺式作用元件。分别将BnSPX3;1启动子(-1742/+21)和BnSPX3;2启动子(-1874/+140)与报告基因GUS融合,构建重组表达载体,转化拟南芥。T3代纯合转基因植株GUS染色表明,两个启动子只在缺磷条件下表现出活性,并且根中的活性要远高于叶中。进一步对BnSPX3;2启动子(-1874/+140)进行缺失分析,结果表明,-1568至-1153,-746至-327,-326至-167,-166至-60之间的区段对缺磷条件下启动子活性有很(极)大影响,是BnSPX3;2启动子响应缺磷的主要调控区域;其中-746至-327之间可能存在全新的响应缺磷的顺式作用元件。将PBnSPX3;2:GUS融合基因转入AtPHR1突变体phr1中,野生型背景转基因植株的GUS的表达量显著高于phr1背景植株,说明BnSPX3;2启动子受转录因子AtPHR1调控。 4. BnIPS1在甘蓝型油菜中至少包括两个同源基因,BnIPS1;1和BnIPS1;2。二者的cDNA全长分别是592和557bp,具有91%的核苷酸相似性,并且含有一段保守序列,与miR399互补。基因结构分析显示这两个基因都没有内含子。BnIPS1;1可能含有两个短的开放读码框(ORF), BnIPS1;2没有开放读码框。进化分析表明BnIPS1;1和BnIPS1;2分别来自白菜基因组和甘蓝基因组。基因表达分析显示BnIPS1;1和BnIPS1;2不仅受缺磷诱导表达,而且受渗透胁迫和盐害诱导表达,但缺磷的诱导程度要强于其它胁迫。并且二者的缺磷诱导表达具有快速、持续和可逆的特点。 5.通过同源序列法分离了BnIPS1;1和BnIPS1;2的启动子,分别位于转录起始位点上游1977和2093bp。两个启动子属于典型的TATA盒型启动子元件,分别含有3和4个P1BS元件。将BnIPS1;1启动子(-1459/+42)与报告基因GUS融合,构建重组表达载体,转化拟南芥。T3代纯合转基因植株GUS染色表明,BnIPS1;1启动子只在缺磷条件下表现出活性。 综上所述,SPX和TPSI1/Mt4家族基因,BnSPX3和BnIPS1,及其启动子的分离和鉴定在油菜中属于首次报道。其中基因BnSPX3可以作为研究油菜缺磷诱导基因表达调控的载体和判断油菜磷缺乏状况的理想标记基因;基因BnIPS1可以作为研究油菜缺磷信号感知和传导的工具。BnSPX3和BnIPS1的启动子可以作为缺磷诱导型启动子应用于植物基因工程中。


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