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芸薹属栽培种的杂种和异源多倍体合成及遗传学

崔成  
【摘要】:种间杂交和异源多倍体化促成很多重要作物的起源。芸薹属三个栽培二倍体种(白菜、黑芥和甘蓝)间的成对杂交产生了三个四倍体种(甘蓝型油菜、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥),它们是十字花科植物重要的蔬菜、油料及饲料作物。人工合成的芸薹属四倍体种已经成为研究异源多倍体中遗传重组和稳定的杂种优势应用最广的模式植物之一,也是拓展种质资源的重要方式。在本研究中通过芸薹属三个栽培二倍体种的成对正反交,获得二基因组二倍体和三倍体杂种(A.B和BB.A, A.C和CC.A, B.C和CC.B)和三基因组三倍体种(A.C.B和C.A.B),相应的双单倍体的染色体加倍得到三个异源四倍体(AA.BB, AA.CC, BB.CC)。利用基因组原位杂父(GISH)和BAC荧光原位杂交,扩增片段长度多态性(AFLP),甲基化DNA扩增片段长度多态性(mAFLP), cDNA扩增片段长度多态性(cDNA-AFLP)及单链DNA构象多态性(SSCP)等方法,分析了杂种和异源多倍体的基因组间和组内染色体配对,遗传学,表观遗传学,基因表达的差异及核糖体RNA表达情况,主要结果如下: 1.杂种表现为亲本中间型,正反交杂种表型更接近母本,特别是BB.A, CC.A和CC.B,可能是因为他们多了一个母本基因组拷贝。三个二基因组二倍体杂种(A.B,A.C, B.C)的育性非常低,两个三基因组杂种(A.C.B, C.A.B)完全是雄性不育的,三个二基因组三倍体杂种(BB.A, CC.A, CC.B)中,BB.A和CC.B的花粉育性明显高于CC.A的。普通细胞学分析表明A.C的配对频率明显高于A.B和B.C的,C.A.B的二价体频率明显低于A.C.B的,BB.A和CC.B的配对频率相似但明显低于CC.A的。 2.原位杂交分析表明杂种中A、B和C基因组内的最高同源配对二价体(autosyndetic bivalents)分别是3、2和3个,A基因组平均有0.32-1.73个,B基因组平均有0.23-0.70个,C基因组平均有0.57-1.14个。BB.A中B基因组最高完全同源二价体(homologous bivalents)为7个,平均有5.35个。CC.A和CC.B中C基因组最高完全同源二价体分别是9和8个,平均有6.29和6.70个。基因组间的最高异配二价体(allosyndetic bivalents)分别是A-C的8个,A-B的5个和B-C的5个。总的来说,A基因组内参与同源配对(autosyndesis),异源配对(allosyndesis)和不配对(单价体)的染色体分别为2.07,3.72和4.21条;B基因组内(除BB.A杂种外)参与同源配对,异源配对和不配对的染色体数分别为1.19,2.47和4.34条;C基因组内(除CC.A和CC.B杂种外)参与同源配对,异源配对和不配对的染色体分别为2.34,2.87和3.79条。BB.A中B基因组内参与完全同源配对,同源配对,异源配对和不配对的染色体分别为10.70,1.06,2.68和1.56条。CC.A中C基因组内参与完全同源配对,同源配对,异源配对和不配对的染色体分别为12.58,0.59,4.09和0.74条和CC.B中C基因组内参与完全同源配对,同源配对,异源配对和不配对的染色体分别为13.40,1.20,1.80和1.60条。在所有杂种中,参与同源配对和异配的B基因组染色体要低于A和C基因组的,且变化的范围更窄。但是在大多数杂种中他们在三个基因组中的频率是相似的。只有在A.C.B中,参与同源配对和异配的B基因组染色体频率要明显低于A和C基因组的。在每个杂种中,除了A.C杂种中A和C基因组的,B.C杂种中C基因组的,CC.B杂种中B基因组的,同源配对的染色体(autosyndetic chromosomes)和频率明显的低于异配的。在所有杂种中,同源配对的平均染色体和频率明显的低于异配的。参与同源配对的A基因组二价体和染色体在A.B间BB.A无显著差异,但在A.C和CC.A间有显著差异,表明B或C基因组的单倍体(haploidy)或二倍体(diploidy)状态对A基因组染色体配对有着不同的效果。参与同源配对的B基因组染色体和频率在B.C和CC.B间无显著差异,表明C基因组的单倍体或二倍体状态对B基因组染色体配对无影响或影响有限。 3.普通细胞学及原位杂交分析表明人工合成的异源四倍体染色体行为并不是完全的二倍体化,单价体和多价体频繁出现。AA.BB的A基因组完全同源二价体(homologous bivalents)明显高于AA.CC的,而AA.CC和CC.AA的无显著差异。AA.BB的B基因组完全同源二价体明显高于BB.CC的。C基因组完全同源二价体在AA.CC, CC.AA和BB.CC三者间无显著差异,异配二价体和三价体分别只在AA.CC和CC.AA中观察到。完全同源和同源四价体(homologous and homoeologous quadrivalents) A-A-A-A以很低的频率出现在AA.BB和CC.AA中。完全同源和异源四价体(homologous and allosyndetic quadrivalents) A-A-B-B, A-A-C-C及B-B-C-C以很低的频率分别出现在AA.BB, AA.CC和CC.AA及BB.CC中。最多有2个四价体出现在AA.CC和CC.AA中。 4.杂种和异源四倍体的AFLP, mAFLP, cDNA-AFLP分析表明,平均分别有21.61%,17.70%,9.34%的总带发生了遗传,甲基化,基因表达变化;新增带出现的频率很低,A,B和C基因组特异带的遗传变化分别为31.28%,31.97%和13.40%。A和B基因组特异带发生遗传变化的百分比相似,但明显高于C基因组的。A,B和C基因组特异带的甲基化变化分别为31.72%,19.09%和13.91%。A基因组特异带发生甲基化变化的百分比明显高于B基因组的,然后高于C基因组的。A,B和C基因组特异带的基因表达变化分别为12.92%,16.32%和8.40%,B基因组特异带发生基因表达变化的百分比明显高于A基因组的,然后高于C基因组的,表明C基因组在杂种和异源四倍体中的遗传,表观遗传和基因表达变化较少。基因组特异带的缺失在不同基因组合,细胞质来源和基因组倍性杂种及多倍体中差异显著。杂种和异源四倍体与其二倍体亲本比较,表明遗传变化以基因组序列消除为主;细胞质效应,倍性水平和亲本基因组的关系是决定基因组偏向性序列消除频率的因素。杂种和相应的异源四倍体间遗传,表观遗传和基因表达变化的比较可以揭示基因组加倍效应。在绝大多数情况下,异源四倍体保留二倍体中的遗传,甲基化和基因表达状态。遗传变化方面,平均77.66%保持不变带,而有18.87%保持变化带,就是说18.87%在二倍体中变化的带可遗传到四倍体中。平均1.38%表现出与二倍体中不变带的不同,平均2.07%表现出与二倍体中变化带的不同。甲基化变化方面。平均80.68%保持不变带,而有9.75%保持变化带。平均4.54%表现出与二倍体中不变带的不同,平均4.22%表现出与二倍体中变化带的不同,最后有大约0.48%表现为二倍体中没有的新增变化带。基因表达方面,平均88.93%保持不变带,而有5.43%保持变化带。平均3.03%表现出与二倍体中不变带的不同,平均2.61%表现出与二倍体中变化带的不同(1.11%,2.17%,4.54%)。这些结果表明基因组融合是引起遗传,甲基化和基因表达变化的主要原因,基因组加倍导致基因表达变化的有限提高。 5.综合AFLP, mAFLP和cDNA-AFLP数据进行相关性分析表明,DNA片段的缺失与cDNA片段的缺失显著相关,mDNA片段的缺失与DNA片段的缺失及cDNA片段的缺失不相关。同时检测了A基因组DNA, mDNA和cDNA片段的缺失的相关性,也检测了B基因组及C基基组的三者之间的相关性,A基因组特异DNA片段缺失与A基因组特异mDNA片段缺失显著相关,B基因组特异cDNA片段的缺失与B基因组特异DNA片段缺失及mDNA片段缺失显著相关,而在C基因组中三者之间没有显著的显性关系。结果表明遗传变化和表观遗传变化造成了基因表达变化,同时甲基化变化与遗传变化有关。 6.cDNA-SSCP分析表明,在BB.A, A.B, AA.BB, CC.B, B.C, BB.CC, C.A.B, A.C.B杂种中,只有来自B基因组的核糖体RNA基因表达,而来自A和C的发生了沉默。在CC.A, A.C, AA.CC, CC.AA杂种中,只有A基因组的核糖体RNA基因表达,而来自C的发生了沉默。表明核糖体RNA的显性梯度为BAC,核仁显性独立于母本效应,倍性水平和核糖体RNA的基因剂量。


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