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基因重组酒香酵母菌株高产β-葡萄糖苷酶的高密度液态发酵模型及酶学性质研究

吴鹏  
【摘要】:β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21),又称β-D-葡萄糖苷水解酶,是组成纤维素酶系必不可少的成分。本研究对产β-葡萄糖苷酶菌株B.anomalus PSY-001分别进行紫外诱变和超声波诱变,从诱变菌株中筛选出高产β-葡萄糖苷酶的两亲株U1和V1,进行三次种内基因重组,以p-葡萄糖苷酶活力为指标,筛选出高产β-葡萄糖苷酶的新融合菌株F3-25,对F3-25的发酵条件进行优化,并建立该菌株的高密度液态发酵模型,采用AKTA purifier-900蛋白分离纯化工作站对该菌株生产的β-葡萄糖苷酶进行分离纯化并进行酶性质分析,为工业化生产提供了可靠的依据。 主要研究内容和结果如下: 1,以B.anomalus PSY-001为出发菌株,分别进行紫外诱变和超声波诱变,从诱变菌株中筛选出高产β-葡萄糖苷酶的菌株进行三次种内基因重组。通过初筛培养基筛选后,再以β-葡萄糖苷酶活力为指标,筛选出高产β-葡萄糖苷酶的新融合菌株F3-25。融合菌株F3-25产β-葡萄糖苷酶的酶活比原始菌株提高了近8倍。 2,运用Design-Expert软件对试验数据进行分析,得到融合菌株F3-25的最佳培养基组成:当麸皮浓度为53.15g/L,酵母粉浓度为3.03g/L,KCl浓度为0.204g/L,CaCl2浓度为0.611g/L时,β-葡萄糖苷酶的酶活最高,为4.794U/mL。 通过单因素试验和正交试验确定了融合菌株F3-25的最佳摇瓶发酵条件:发酵温度为30℃、250mL锥形瓶装液量为20mL、摇床转数为150r/min、接种量为3%、初始pH值为5。 3,对F3-25的补料分批发酵条件进行了优化。运用Orign8.0软件拟合得到融合菌株F3-25在该条件下的生长动力学模型为: 4,利用AKTA purifier-900蛋白分离纯化工作站,采用葡聚糖凝胶G-100层析,使β-葡萄糖苷酶的纯化率达到了96.2%,经SDS-PAGE电泳检测为电泳纯,得到两条带,测定其两个亚基的分子量分别为50.3KDa和67.8KDa,运用电泳分析软件BandScan4.3对电泳结果进行分析,得到其亚基的含量分别为40.5%和57.3%。 融合菌株F3-25发酵产生的β-葡萄糖苷酶,最适反应温度为60℃,在40℃~50℃温度条件下,具有较好的热稳定性;最适pH值为5.0,在pH为5.0~6.0范围内,具有较好的稳定性;Fe3+、Mn2+、Ca2+对β-葡萄糖苷酶酶活有明显的促进作用,而Mg2+、Al3+、Cu2+、Zn2+对β-葡萄糖苷酶酶活有抑制作用。


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