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桑黄菌丝体多糖的分离纯化、结构鉴定及生物活性研究

胡启明  
【摘要】:桑黄作为一种珍贵的药用真菌,其杰出的生理功效备受人关注,尤其是抗肿瘤效果极佳。目前主要是针对桑黄的子实体多糖进行研究,但其子实体稀少。固态发酵生产菌丝体多糖尚鲜有报道。本文利用实验室固态发酵培养的桑黄菌丝体,提取纯化其中的多糖成分,分析多糖组分的结构,并开展一系列的生理活性研究,研究其理化性质,为桑黄保健品的规模化开发提供理论依据。 桑黄菌丝体通过粉碎过筛,90℃水浴3h,去除淀粉,除蛋白,醇沉,依次利用DEAE-52, G100纯化柱进行分离,得到三种不同的多糖组分。对这三种多糖组分进行紫外全波段扫描以及HPLC分析,结果表明分离所得的三种桑黄多糖Plps-1, Plps-2, Plps-3为均一的组分。 通过凝胶色谱法进行测定可以算出Plps-1的相对分子量为2.5×105Da, Plps-2的相对分子量为1.25×105Da, Plps-3的相对分子量为2.8×104Da。单糖组分分析可以得知,Plps-1中所含单糖比例为阿拉伯糖:半乳糖:岩藻糖:木糖:葡萄糖=1.336:1:1.182:1:21.964。 Plps-2中所含单糖比例为阿拉伯糖:半乳糖:甘露糖:岩藻糖:木糖:葡萄糖=3.780:3.898:3.372:1.912:1:10.430。Plps-3中所含单糖比例为阿拉伯糖:半乳糖:甘露糖:岩藻糖:木糖:葡萄糖=1.552:2.594:1.956:1.466:1:14.368。GC分析结果表明Plps-1中的1→4键合的糖基的比例为63.97%,以1→3键合的糖基的比例为12.61%,以1→6键合的糖基或非还原末端糖基的比例为23.42%;Plps-2中的1→4键合的糖基的比例为61.09%,以1→3键合的糖基的比例为14.05%,以1→6键合的糖基或非还原末端糖基的比例为24.86%; Plps-3中的1→4键合的糖基的比例为11.71%,以1→3键合的糖基的比例为46.85%,以1→6键合的糖基或非还原末端糖基的比例为41.44%。根据红外光谱图可以看出Plps1和Plps2含有不饱和的-CH,-C=C-,-CH3,-C-O-C,-OH,-NH2, β-糖苷键相连的吡喃环多糖;Plps3含有不饱和的-CH,-C=C-,-C-O-C,=CH2,-OH,-CH3,-C=O,既含有α-糖苷键也含有β-糖苷键的吡喃环多糖。 研究表明,三种桑黄多糖组分的还原力的测定以及对羟自由基清除的实验,结果表明三中桑黄多糖组分都有一定抗氧化效果,但不具有显著性。Plps-1能够抑制S180的体外增殖,抑制率高达93.6%;Annexin V-FITC/PI细胞周期以及细胞凋亡效果实验,进一步证明Plps-1能够诱导肿瘤细胞的凋亡,使其停止在G1期。通过测定细胞因子TNF-α的含量发现,三种桑黄多糖均可一定程度地抑制TNF-α的产生,表明桑黄多糖在抗肿瘤方面没有毒副作用。在脾细胞实验中,可以发现三种桑黄多糖都能够极为显著地增强其活力,呈现一定的剂量关系。其中在添加浓度为200μg/mL时Plps-1、Plps-2、Plps-3可分别能够提高脾细胞活力4180.538%、6843.064%;542.6471%。在胸腺细胞体外增殖实验中,也可发现两种桑黄多糖Plps-1和Plps-2都能够极为显著地增强其活力。其中Plps-1在100μg/mL时能够提高13232.7%;Plps-2在200μg/mL时能够提高11215.8%;Plps-3在100μg/mL时能够提高32.967%但不具有显著性。在巨噬细胞吞噬中性红实验中,只有Plps-1能够显著性的提高其吞噬能力,在200μg/mL时的Plps-1能够提高吞噬能力54.675%。在巨噬细胞分泌NO实验中,三种桑黄多糖组分都能够显著性的提高巨噬细胞的分泌能力,Plps-1在200μg/mL时能够提高173.590%; Plps-2在200μg/mL时能够提高167.436%;Plps-3在200μg/mL时能够提高108.974%。


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