小立碗藓羟基肉桂酰酰基转移酶基因功能及调控研究初探

【摘要】：在陆生植物的演化过程中,苯丙烷类化合物扮演着重要作用。小立碗藓在进化过程中处于植物从水生向陆生生境进化的过渡阶段,研究小立碗藓的苯丙烷代谢途径可使我们进一步了解苯丙烷类化合物的进化历程。本实验室此前构建了汇集苔藓植物,单子叶植物与双子叶植物中研究较多的几种模式植物BAHD家族基因的进化树。在其中的一个进化支中,数种植物的苯丙烷代谢途径中的HCT功能已经鉴定,但小立碗藓的HCT功能并未报道。本研究以此为基础,利用原核表达、超量表达、酵母单杂、及烟草荧光素酶检测系统来研究小立碗藓PpHCT的功能,为研究小立碗藓苯丙烷代谢途径提供依据。本研究获得的主要研究结果如下： 1.通过PCR获得PpHCT基因全长cDNA序列和部分截短的cDNA序列,并克隆到原核表达载体pJAM1786上,分别命名为pJC2和pJC1196。将它们转入菌株BL21中表达,PpHCT获得可溶性蛋白上清液。利用可溶性蛋白上清液检测了PpHCT的底物特异性。HPLC-MS结果显示当以p-coumaroyl CoA为酰基供体时,PpHCT催化反应的酰基受体为quinate和shikimate;当以caffeoyl CoA, feruloyl CoA为酰基供体时,PpHCT催化反应的酰基受体只能是shikimate; PpHCT催化反应不能以sinapoyl CoA为酰基供体。PpHCT的底物亲和力高低为coumaroyl quinate coumaroyl shikimate caffeoyl shikimate feruloyl shikimat。此结果说明PpHCT具有酰基转移酶功能,但底物广谱性与其他物种有所区别。这种区别可能是PpHCT比其他物种HCT多出一段氨基酸序列所致。 2.通过gateway克隆将PpHCT全长cDNA序列和部分截短的cDNA序列构建到超表达载体PH2GW7(含Ubiquitin启动子)和pB7WG2.0上,分别命名为pJC554、 pJC557、pJC555和pJC556。通过PEG介导的原生质体转化法将pJC554转化到小立碗藓原生质体中,获得抗性小立碗藓植株；通过拟南芥的蘸花法将pJC555和pJC556转化到拟南芥野生型中,分别得到7和5株T1代阳性植株：利用根癌农杆菌介导法将pJC554和pJC557转化到水稻ZH11愈伤,分别得到30和10株T0代阳性植株。 3.通过RT-PCR方法检测了pJC554, pJC557转化得到的阳性植株分蘖期PpHCT和OsHCT的表达量和pJC555, pJC556转化阳性植株抽苔期PpHCT和AtHCT的表达量。结果显示转基因阳性植株中PpHCT基因都得到了超量表达；同时,OsHCT与AtHCT在相应的转基因植株中没明显变化。利用HPLC-MS检测了异源超表达了小立碗藓PpHCT在抽苔期拟南芥与分蘖期水稻中的PpHCT酶反应产物,氨基酸与部分黄酮类物质的变化。结果显示,在PpHCT阳性转化植株中部分酶反应产物得到提高,而这种变化在PpHCT-deletion中不存在,说明PpHCT序列的完整性对其功能发挥是必须的。 4.通过将小立碗藓基因组中预测的R2R3型MYB与拟南芥和水稻中已报道的调控木质素的MYB进行序列比对,筛选出可能调控PpHCT的MYB基因。通过PCR获得这些基因的全长CDNA序列,并克隆到带35S启动子的载体pB7WG2.0上。同时通过PCR获得PpHCT上游1.9kb的启动子片段和AtHCT上游1.5kb的启动子片段克隆到带荧光素酶报告基因的载体pGW::Luciferase上。通过荧光素酶检测检测系统检测MYB与HCT之间的作用得知,AtMYB58和AtMYB63能促进HCT的表达,PpMYB58、PpMYB63能抑制HCT的表达。从结果可以推断PpMYB对HCT的抑制作用是小立碗藓中没有木质素合成的部分原因。