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花生红衣原花青素的分离鉴定及其对丙烯酰胺抑制作用的研究

陈洋  
【摘要】:自2002年发现经高温加热或油炸的食品中存在准致癌物-丙烯酰胺(AM)以来,人们开始广泛地关注这一问题产生的原因以及如何控制食品加工过程中AM的产生。从食品加工过程中AM产生的机理入手,寻求抑制AM生成的办法,是广大学者们所热衷研究的内容。现有研究证实通过添加食品添加剂可以有效控制食品加工过程中AM的产生,包括添加酸度调节剂、氨基酸或者蛋白质、维生素等皆可以减少高温加热或油炸食品中AM的含量,最新研究证实生物黄酮类化合物是一种更值得关注的AM抑制剂,抑制机理主要归结于其结构中存在活性强的酚羟基。原花青素作为一种富含多个活性酚羟基的黄烷醇,已有文献证实其可能是一种新型、高效的影响食品加工过程中AM产生的抑制剂。但是由于原花青素结构复杂(有A型和B型两种结构,有多种聚合度),其量效关系、构效关系如何,还远未被揭示清楚。本研究以富含A型和B型低聚体原花青素的花生红衣作为研究材料,对其中的原花青素进行分离和鉴定;与此同时,建立可稳定产生AM的模拟体系以及可准确、灵敏检测所产生的AM的分析方法;在此基础上研究不同结构花生红衣原花青素对AM的抑制效果。主要研究内容和研究结果如下: 1.花生红衣中原花青素的提取、分离和鉴定。采用70%乙醇溶液提取花生红衣中的原花青素,通过AB-8大孔树脂纯化并采用正丁醇-盐酸法测定花生红衣原花青素混合物(PSP)的纯度,通过Toyopearl HW-40凝胶色谱,甲醇作为流动相,将PSP进行分离,利用RP-HPLC-MS/MS对凝胶分离级分进行进一步分离和鉴定。经AB-8树脂纯化后原花青素混合物的纯度大于98.0%,得率为9.8%。凝胶色谱将PSP分离成PSP-1~SP-8,即8个含有不同分子质量大小或构型的原花青素级分。通过RP-HPLC-MS/MS分析技术对其中的6个级分进行分析,结果表明:PSP-1是以儿茶素或者表儿茶素为结构单元的黄烷醇单体,PSP-2由2种B型原花青素二聚体组成,PSP-3主要是由4种B型原花青素二聚体构成,PSP-4是由4种A型原花青素二聚体组成,PSP-5是具有原花青素单体、A型原花青素二聚体与三聚体的混合物,PSP-6主要是由2种A型原花青素三聚体形成。 2.AM的HPLC-DAD分析方法的建立。选用Hypercarb色谱柱,检测波长:205nm,进样量:10μL,流动相为纯水,柱温为40℃,流速:0.6mL/min,运行时间:15mmin。并分别考察了精密度、稳定性、定量限和检出限。精密度与稳定性的峰面积相对标准偏差均小于5.0%,说明该方法准确度与稳定性均较高;根据信噪比(S/N)分别为3和10时,确定其检出限为0.05μg/mL、定量限为0.10μg/mL。AM线性范围为0.5μg/mL-5.0μg/mL时,标准曲线方程为y=145366x-16907(R2=0.9983);线性范围为5.0μg/mL-30.0μg/mL时,则AM标准曲线的方程为y=144914x+4517.5(R2=0.9999)。 3.建立化学模拟体系中AM提取及SPE富集方法。通过比较HyperSep Retain PEP和Oasis HLB两种SPE柱的富集效果和回收率,选用Oasis HLB柱进行SPE分离。AM属于极性物质,易溶于水和有机溶剂中,分别比较了甲醇,乙腈,乙酸乙酯,0.1mol/L、 pH6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)对化学模拟体系中的AM提取效果,通过所建立的HPLC-DAD分析方法,并结合回收率分析发现:PBS对化学模拟体系中的AM提取效果最好,其回收率达到74.75%-105.00%。 4.优化并确立了天冬酰胺和葡萄糖在高温下反应生成AM的反应体系。在等摩尔(0.5:0.5)的天冬酰胺和葡萄糖参与反应的前提下,分别考察PBS体积、加热时间、加热温度三个因素对AM生成的影响,天冬酰胺和葡萄糖模拟产生AM量最大的条件为:PBS的添加量为1.5mL、反应温度175℃,加热40min。 5.不同PSP级分对AM抑制效果的比较。研究了PSP-1对AM抑制效果的量效关系,分别比较了0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL PSP-1对AM产生的抑制效果,当PSP-1浓度为0.5mg/mL时,其抑制率为54.4%达到最高。在此基础上下,分别比较了PSP-1。、 PSP-2、 PSP-3、 PSP-4、 PSP-5、 PSP-6对AM的抑制效果,发现PSP-1(儿茶素和/或表儿茶素)、PSP-2(B型原花青素二聚体)、PSP-4(A型原花青素二聚体)、PSP-5(原花青素单体、A型原花青素二聚体与三聚体的混合物)的抑制率均在50.0%左右,PSP-3(B型原花青素二聚体)的抑制率达到了74.3%,PSP-6(A型原花青素三聚体)的抑制率只有30.7%。结果说明原花青素的构型、数量、聚合度、空间结构可能对AM的抑制效果有影响,而且B型原花青素可能对AM的抑制率比A型原花青素高。


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