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团头鲂β-防御素基因的克隆、重组表达及抗菌作用研究

张涓  
【摘要】:防御素(Defensin)是一种广泛存在于动物、植物体内、带正电荷的小分子量抗菌肽。防御素具有广谱的抑制和杀灭细菌、真菌、病毒以及肿瘤细胞等作用,在天然免疫中起重要作用。 团头鲂(Megalobrama amblycephala)是一种重要的淡水经济鱼类。本研究以团头鲂为研究对象,运用分子生物学技术,克隆出团头鲂β-防御素(p-defensin)cDNA核心序列,对团头鲂β-防御素在组织中的分布情况以及在嗜水气单胞菌感染后组织中β-防御素表达水平的变化进行了分析,将团头鲂β-防御素基因分别构建至大肠杆菌和毕赤酵母表达载体上,进行了重组表达,并对表达产物进行了活性分析。实验结果如下: 1.团头鲂β-防御素的克隆及表达分析 获得的团头鲂β-防御素cDNA核心序列为334bp, ORF区为204bp,在NCBI上blast比对结果显示:团头鲂β-防御素cDNA序列与斑马鱼和鲤鱼的cDNA序列相似性最高,分别达到90.2%和86.3%。氨基酸序列中包含防御素典型的6个半胱氨酸结构。团头鲂β-防御素基因广泛分布于肝脏、脾脏、头肾等组织中。团头鲂在感染嗜水气单胞菌后,β-防御素基因在肝脏、肠中的表达量变化不显著(p0.05);在头肾中,感染后12h和24h团头鲂β-防御素基因的表达量出现显著的上调;在脾脏中,嗜水气单胞菌在感染后72h时,出现极显著的上调(p0.05)。 2.团头鲂β-防御素在大肠杆菌中的表达 成功构建大肠杆菌表达载体pGEX-KG-β-defensin。在1mmol/L的IPTG条件下诱导表达出重组蛋白,重组蛋白经分离纯化后进行抑菌实验,结果显示表达的重组融合蛋白无抑菌活性。将该融合蛋白制备了多克隆抗体,ELISA和western-blot检测结果表明:抗体效价在1:3200以上。在肝脏、鳃和心脏组织中用Western Blot可检测到β-防御素。 3.团头鲂β-防御素在毕赤酵母中的表达 成功构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-β-defensin。对阳性菌株进行甲醇诱导,诱导表达结束后,采用饱和硫酸铵法对表达产物进行浓缩,牛津杯法鉴定表达产物的抑菌活性。结果表明:重组蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌和温和气单胞菌都产生了抑菌活性。


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