猪链球菌2型cps2E基因缺失株构建及生物学特性研究

【摘要】：猪链球菌病是由猪链球菌(Streptococcus suis, S. suis)感染引起的人畜共患疾病,不仅对全球养猪业造成巨大冲击,而且严重威胁人类的公共健康。在中国,1998年和2005年先后暴发两次人感染猪链球菌的疫情,这引起了国内外学者对该病的广泛关注。已知猪链球菌通过破坏宿主的上皮屏障进入血液,进而侵袭不同的器官使宿主患病。该菌主要引起猪的急性败血症、脑膜炎、关节炎、急性死亡等,在人体中则会导致细菌性脑膜炎和链球菌中毒性休克综合征等疾病。猪链球菌血清型众多,其中猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype2, S. suis2)是主要的病原菌,具有毒力强、流行广、临床分离率高的特点。 近年来,对S. suis2致病机理及毒力因子的研究表明,荚膜多糖(Capsular Polysaccharide, CPS)是该病原菌公认的毒力因子之一。Smith等已经获得了合成猪链球菌2型CPS的基因簇, Van Calsteren也初步预测了该基因簇编码的蛋白在CPS重复单元合成中的酶促功能。尽管如此,尚缺少实验进一步证实这些基因的具体功能。因此,为了加深对猪链球菌2型CPS在其致病过程中所发挥的作用以及多样性和进化的了解,进一步研究猪链球菌2型CPS生物合成的相关基因是必需的。 Yother预测肺炎链球菌2型的Cps2E蛋白在其Wzx/Wzy依赖的CPS生物合成途径中发挥着起始糖基转移酶的作用。此外,Smith等经试验发现S. suis2的cps2E基因具有较高的2型特异性。因此本研究选取S. suis2的CPS生物合成相关基因cps2E,主要研究该基因在CPS生物合成中的功能,并为其他CPS合成相关基因的功能研究奠定基础。本文主要研究内容如下： 1.猪链球菌2型cps2E基因生物信息学分析： 将S. suis的3株代表性菌株SC8、05ZYH33及P1/7的CpsE蛋白序列与不同种属细菌来源的相应蛋白进行同源比对及亲缘关系分析。结果表明：S. suis的SC84菌株CpsE蛋白质序列与05ZYH33、P1/7菌株的一致性分别高达98%和100%,具有同源性；同时,S. suis的CpsE蛋白与肺炎链球菌、无乳链球菌之间的亲缘关系相近。 2. cps2E基因缺失突变株S.cps2E的构建： 根据S. suis2菌株05ZYH33全基因组序列(Accesion No.:NC_009442)设计引物,其中cps2E的基因位点为SSU05_0568。以S. suis2四川分离菌株SC19的基因组为模板进行重叠延伸PCR扩增,获得cps2E基因上下游同源臂的连接产物。将扩增产物与pSET4s穿梭质粒载体分别双酶切处理后进行连接,最终获得重组质粒pSET4s-△cps2E,经PCR扩增及双酶切鉴定成功。 将获取的重组质粒pSET4s-△cps2E电转化到野生菌株SC19的感受态细胞中。进而利用pSET4s质粒的温敏性、壮观霉素抗性及同源重组原理筛选获得cps2E基因缺失突变株。菌株经PCR扩增及测序证实S. suis2的cps2E基因缺失突变株△cps2E构建成功。 3.突变株△cps2E生物学性状分析： 将获得的cps2E基因缺失突变株Acps2E与野生菌株SC19于37℃进行生长特性分析。继而分别将突变株Acps2E与野生菌株SC19腹腔接种4周龄BALB/c雌性小鼠后,再经2次腹腔液转种,分离纯化血中的细菌。然后对分离后的两种菌株进行革兰氏染色,透射电镜观察以及荚膜粗多糖的提取。研究结果表明：Acps2E对数期的生长速率明显加快,稳定期的菌量也明显增大；△cps2E的形态多呈单个或两两排列,不同于野生菌株的链状排列,并且Acps2E的荚膜同野生菌株存在显著差异；△cps2E荚膜粗多糖的提取率仅为野生菌株的34.52%。 4.突变株Acps2E生物学功能分析： 将突变株△cps2E与野生菌株SC19于37℃,5%CO2条件下进行细胞粘附侵入及吞噬试验。一方面,对人子宫颈癌细胞(Hela)的粘附侵入试验结果表明：△cps2E的粘附能力差异不明显,而侵入能力显著增强,是野生菌株的1.65倍；另一方面,小鼠肺泡巨噬细胞(RAW264.7)的吞噬试验结果表明：在4个互作时间段内,RAW264.7对△cps2E的吞噬率均极显著高于野生菌株,故突变株△cps2E的抗吞噬能力极显著降低,更易被机体清除。 突变株△cps2E与野生菌株SC19分别腹腔接种4周龄BALB/c小鼠,LDso的测定结果显示突变株Acps2E毒力下降4.47倍,cps2E基因对细菌的致病性存在影响。小鼠存活率试验中,突变株△cps2E组的小鼠存活率为100%,野生菌株组的小鼠存活率仅为30%,△cps2E对小鼠的毒力显著减弱。小鼠感染后血中载菌量的动态变化显示,△cps2E含量呈现逐日剧减的趋势,且于感染后第5天被机体彻底清除,而野生菌株此时仍在血中保持一定菌量。