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硒矿土壤中硒还原菌的多样性及硒抗性分子机制的研究

粟静  
【摘要】:硒(Se)是生命体所必需的微量元素,是硒代半胱氨酸和含硒酶的必须组份,在抗癌、抗氧化等方面发挥重要作用,但过量硒具有毒性。自然界中,硒主要以4种价态存在:(-2)、Se(0)、Se(+4_Se(+6)。其中亚硒酸盐(+4)毒性最强。已有研究表明硒在自然界的转化离不开微生物的作用。目前,国际上微生物代谢硒的研究活跃,已发现多个种属的细菌对硒具有抗性和还原性,但在分子机理研究上,Se(Ⅳ)的硒还原酶和关键基因还不清楚。本研究旨在从富硒土壤中分离硒还原菌,研究其多样性,并对一株代表菌Comamonas testosteroni S44进行了硒抗性和还原性相关基因的研究。 本研究从湖北恩施某矿洞外采集土样ES2,经测定其硒含量为38.35mg/kg,表明采集地属于高硒矿区。对从恩施矿土ES2中分离到的35株硒还原细菌进行了16SrRNA基因测序,初步鉴定这些菌株分布于放线菌门(Actinobacteria)、变型细菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes),共包括20个属29个种,多样性丰富。通过Se(IV)的MIC和还原效率的测定,发现细菌对Se(IV)的MIC和还原效率与细菌种属均无关,且还原效率与MIC不存在对应关系。这说明细菌对亚硒酸盐还原和抗性的机制可能不同。 为了进一步研究细菌硒代谢分子机理,本实验以Comamonas testosteroni S44为实验菌株,采用Tn5转座子插入突变方法找到一个与硒抗性和还原性均相关的基因-iscR。而后通过基因互补和荧光定量RT-PCR实验证明:iscR基因与硒抗性和还原性均相关。从细胞内GSH含量测定推测还原型谷胱甘肽可能参与细菌亚硒酸盐的还原。 综上所述,我们预测在Comamonas testosteroni S44细胞内,IscR蛋白参与的硒还原代谢机制可能为:Se(VI)被周质空间的硒酸盐还原酶复合体还原为Se(IV)后进入细胞质,再被细胞质中的GSH或酶类还原为单质硒,细菌在亚硒酸盐或硒酸盐的还原过程中产生大量的过氧化物,造成氧化胁迫,为应对氧化胁迫环境,isc操纵子处于去抑制状态,促进菌体内Fe-S和GSH的合成。一方面Fe-S与蛋白结合形成铁硫蛋白酶类参与Se(IV)或Se(Ⅵ)的还原,另一方面GSH参与亚硒酸盐的还原,与Se(IV)反应生成GS-Se-SG,在GSH还原酶的作用下生成GS-Se-, GS-Se-不稳定,最终分解成Se和GSH。同时在硒还原过程中IscR还可能促进Comamonas testosteroni S44中其他与铁硫簇的生物合成有关的基因。 本课题初步阐明了硒还原菌的多样性,以及细菌亚硒酸盐MIC和还原效率与细菌种属的关系,并首次报道了iscR与亚硒酸盐抗性,还原性及硒酸盐还原性均相关,其结果对微生物硒代谢机理的研究提供了科学依据。


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