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云南大叶种茶树多酚氧化酶的分离纯化与性质研究

虞昕磊  
【摘要】:多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)是红茶品质形成的关键因素,为此本课题选用PPO活性较高的“云大”凤庆种鲜叶为材料,经提取、分离纯化,得到两条PPO同工酶,并分别做了较全面的酶学特性研究。具体结果如下:(1)依据酶活力、Native-PAGE电泳图等,优化确定凤庆PPO最佳提取条件﹕取适量茶鲜叶,以料液比1:3(W/V)加入4℃预冷的柠檬酸盐缓冲液(0.1 mol/L,p H 7.2),和5%(g/m L)PVP冰浴研磨,浆液4℃浸提12 h,9000 r/min,4℃离心30 min,取上清,得PPO粗酶液。(2)制备的凤庆PPO粗酶液,经硫酸铵分级沉淀、离子交换层析(DEAE-Sepharose CL-6B)和凝胶过滤层析(Sephadex G-150),分离纯化得到2条同工酶:PPOⅠ,约35 k Da的单一蛋白亚基,纯化倍数19.45;PPOⅡ,55-66.2 k Da的两个蛋白亚基结合体,纯化倍数30.18。(3)PPO同工酶性质分析(以邻苯二酚为底物):PPOⅠ和Ⅱ的最适反应温度均为40℃,最适p H分别为5.2、5.6,最适Cu2+浓度分别为0.5×10-7mol/L和1.00×10-7mol/L。抑制剂对凤庆PPOⅠ和Ⅱ的作用强弱次序:抗坏血酸亚硫酸钠EDTA半胱氨酸,抗坏血酸最高浓度时,酶活下降50%。凤庆PPO最适底物是邻苯二酚和焦没食子酸,可部分氧化没食子酸、对苯二酚,对间苯二酚作用最弱。酶动力学参数:以邻苯二酚为底物,PPOⅠ和Ⅱ的Km分别为4.42和3.46 mmol/L,PPOⅡ以焦没食子酸做底物的Km为3.46 mmol/L,但邻苯二酚的Vmax大于焦没食子酸,说明PPO与邻苯二酚亲和更强。


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