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抗赤霉病相关基因转化小麦及其抗病性分析

程伟  
【摘要】:小麦赤霉病是由镰刀菌引起的一种世界范围内广泛流行的真菌病害。近年来,由于全球气候变暖和耕作制度、耕作方式的改变,小麦赤霉病显现逐年加重和大流行的趋势,对农业生产构成严重威胁。小麦赤霉病主要发生在穗期,造成穗腐,也可以在苗期引起苗枯、基腐等症状,它的发生不仅造成产量和品质的下降,而且产生多种毒素,影响食品安全及人畜健康。培育和推广抗赤霉病的小麦品种,是控制小麦赤霉病的有效途径。但是,由于小麦-镰刀菌互作机制复杂,小麦品种天然抗病资源稀少,抗性遗传基础狭窄,利用常规育种培育抗病且综合性状优良的品种难度较大。基因工程育种技术的日趋成熟为解决这一难题提供了新的途径。既可利用小麦天然抗源外,还可以充分利用其他植物、动物和微生物的抗病基因资源,通过转基因技术创造目标性状突出且综合性状优良的抗赤霉病新品系,具有广阔的发展与应用前景。本研究采用基因枪介导的最小表达框转化法,将来源与抗性机制不同的抗赤霉病相关基因导入郑麦9023,扬麦158以及扬麦15等我国小麦主栽品种,旨在为小麦抗赤霉病转基因育种创造新材料。主要结果如下:1.以郑麦9023为受体品种,成功导入了由大麦颖壳特异Lem2启动子驱动的抗体融合蛋白Ech42CWP2。其中Ech42是一个来源于生防菌哈茨木霉的几丁质酶基因,CWP2是一个来源于鸡的镰刀菌特异单链抗体基因。由Lem2启动子驱动的外源基因在转基因小麦中仍保留着外稃/内稃组织特异表达特性。分别对T3~T6代转基因小麦进行单花接种和自然接种鉴定,表明:转基因株系Z1和Z4在不同世代均具有稳定的赤霉病抗侵入和抗扩展能力。利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对转基因株系进行毒素含量测定,结果表明其成熟籽粒毒素积累量也显著降低。将获得的转基因株系Z1和Z4分别与感病品种华麦13进行杂交,其杂交后代的赤霉病抗性也获得了显著提高。q RT-PCR分析表明Lem2启动子驱动的Ech42CWP2基因受外源施加水杨酸(SA)上调表达,并且镰刀菌的侵染能导致其表达水平有更大幅度的提高。因此,Lem2启动子具有外稃/内稃组织特异表达和受镰刀菌诱导表达的双重特性,由其驱动的抗体融合蛋白Ech42CWP2能够提高小麦的抗赤霉病能力。2.以扬麦158为受体品种,成功导入了3个来源与抗性机制不同的抗赤霉病相关基因Zm GC、ACE和Ech42。这3个目的基因均由来源于玉米的组成型表达启动子—Ubi启动子驱动,其中Zm GC为玉米鸟苷酸环化酶;ACE是一种来源于洋葱种子的抗菌肽;Ech42是一种来源于哈茨木霉的几丁质酶。通过不同世代的PCR,RT-PCR以及Southern blot分析,检测了转基因的遗传与表达稳定性。与之前报道的质粒转化法类似,最小表达框转化法获得的转基因植株(尤其在T3代以内)也会出现随机的转基因遗传不稳定以及转基因沉默现象。通过RT-PCR以及接种鉴定,筛选获得了一个能稳定遗传与表达的转基因株系Y3b-1,并且在T4~T7代均表现出稳定的赤霉病抗性。此研究揭示了通过分子鉴定结合表型筛选,从中获得目标性状突出的转基因株系的重要性;还揭示了在植物中共表达各种来源与抗性机制不同的抗病相关基因,可以实现多层次和多水平的持久抗性。3.以郑麦9023为受体品种,获得了能稳定遗传的2个转基因株系CZI和SZP。其中CZI株系含有2个目的基因Hv Chi CWP2和UEch42,SZP株系含有1个目的基因UEch42。Hv Chi CWP2和UEch42基因均由Lem2启动子驱动,其中Hv Chi CWP2是由来源于大麦的几丁质酶Hv Chi和镰刀菌特异单链抗体CWP2构成的抗体融合蛋白;UEch42是经密码子优化后的Ech42基因。通过不同世代的PCR检测表明:SZP株系于T4代达到纯合;而CZI株系T1~T4代PCR阳性与阴性植株的分离比分别为1:3.5,1:3.2,1:3.0和1:2.4,呈现出异常分离的现象。对所获得的T4代植株进行单花接种鉴定,表明:与受体对照郑麦9023相比,SZP株系的抗病性提高不显著,CZI株系的抗赤霉病能力具有显著提高。4.以扬麦15为受体品种,获得了能稳定遗传的转基因株系SYP。该株系含有2个目的基因AFP2CWP2和D4E1,均由Ubi启动子驱动。其中AFP2CWP2是从萝卜种子中分离获得的一种抗菌肽AFP2和镰刀菌特异单链抗体CWP2构成的抗体融合蛋白;D4E1是一种人工合成的抗菌肽。通过不同世代的PCR检测表明:SYP株系T1~T4代PCR阳性与阴性植株的分离比分别为1:1.7,1:1.5,1:1.5和1:1.2,也呈现出异常分离的现象。对所获得的T4代植株进行苗期接种与单花接种鉴定,表明:与受体对照扬麦15相比,SYP株系的抗穗腐和抗苗腐能力均显著提高。但遗憾的是,这个株系穗型发育不正常,具体原因还有待进一步分析。5.几丁质合成酶基因Chs3b是一个禾谷镰刀菌生长发育致死基因,针对该基因c DNA序列的不同区段,将3个植物RNAi载体Chs3b RNAi-1,-3和-5共转化扬麦15。对其T3~T5代转Chs3b RNAi基因小麦株系L1和L3进行接种鉴定,其抗苗腐和抗穗腐的能力均显著提高。Northern blot检测显示转Chs3b RNAi基因株系能够形成相应的~21 nt小干扰RNA(si RNA)分子,并能够有效的干扰入侵的禾谷镰刀菌Chs3b基因的表达。共聚焦显微观察发现:禾谷镰刀菌接种后的转Chs3b RNAi基因株系中菌丝生长受到了严重的抑制。因此,以禾谷镰刀菌Chs3b基因为靶标的宿主诱导的基因沉默(Host-induced gene silencing,HIGS)技术能够有效提高小麦的赤霉病抗性。由于具有针对核苷酸序列的靶向特异性,这项技术为培育基于病原菌抗性的转基因作物奠定了基础,显示了巨大的应用潜力。


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