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卡介苗基因缺失株BCGΔWag22的构建及BALB/c小鼠潜伏感染模型的建立

赵静  
【摘要】:结核分枝杆菌是造成结核病的主要病原,结核病作为一种世界性的疾病,在全世界范围内造成了巨大的精神和物质伤害。在完成结核分枝杆菌群基因组测序后,发现了一个在全基因组中占有10%的比重的一个家族---PE和PPE家族,而PE家族根据其C端的序列的不同特点分为pe和pe-pgrs亚家族,PPE家族分为ppe-mptr(major polymor phictandem repeats),ppe-svp(with a Gxx SVPxx W motif),ppe-ppw(with a Pxx Pxx W motif)和ppe(with no distinctive features)亚家族,本研究中涉及到的基因Wag22属于pe-pgrs亚家族,该家族特点是C端序列的高GC含量(≥60%)且含有非常多的GC重复序列,这就增大了体外扩增目的基因的难度。只有少量的文献对Wag22有报道,指出Wag22只有在感染宿主后才会表达,且表达产物Wag22蛋白具有纤维连接蛋白活性,可能在结核分枝杆菌感染宿主的早期发挥一定的作用。本研究以卡介苗BCG为亲本菌株,敲除目的基因Wag22后对小鼠巨噬细胞RAW264.7的影响来探讨目的基因在感染宿主时所发挥的作用,同时在获得缺失株的基础上,利用BCG和缺失株建立一个潜伏感染的动物模型。(1)BCG基因缺失株的构建本研究构建了一个分枝杆菌噬菌体,该噬菌体中含有目的基因上下游同源臂和筛选基因Hyg和sac B的同源重组载体,利用噬菌体感染BCG时将同源重组载体注射到BCG细胞内,发生同源重组后利用筛选基因筛选出阳性克隆子,最后用PCR的方法对阳性克隆子进行鉴定,将鉴定正确的阳性克隆子进行测序,检测目的基因区域的序列。最后成功获得BCG基因缺失株BCG?Wag22。(2)缺失株BCG?Wag22表型的变化成功获得突变株后,我们对突变株和BCG进行了菌落形态、生长曲线、细胞毒性、抗吞噬和存活能力的检测。发现缺失Wag22后菌落形态和生长曲线没有明显差异,但在抗吞噬和存活能力检测方面,BCG?Wag22更易被吞入巨噬细胞内,吞入细胞后,在胞内的存活率没有差别。而细胞毒性方面缺失株对细胞的毒性稍大一些,这些表型的变化可能代表缺失株BCG?Wag22更容易进入宿主并长期在宿主内存在,刺激机体产生长期的免疫力。(3)蛋白Wag22的体外表达由于Wag22只在感染宿主后才表达,所以我们对目的基因进行体外原核表达,选取p ET-28a原核表达载体成功构建了Wag22-p ET-28a质粒,在体外获得了包涵体蛋白,并对包涵体蛋白进行复性,获得了复性后的Wag22蛋白。但由于蛋白的浓度过低无法进行下一步实验,我们会尝试其他的表达方法完成这个实验。(4)潜伏感染动物模型的建立我们利用缺失株BCG?Wag22和BCG来建立潜伏感染模型,选择的实验动物为6-8周龄雌性BABL/C小鼠,以尾静脉注射的方式向小鼠体内注入5×105CFU/200μL的细菌,在两个月的实验时间内观察结核病典型病变-肉芽肿,我们选取了三个时间段进行观察,我们得到的观察结论是,突变株组与BCG组引起类似的病变,病变部位主要集中在脾脏和肝脏,心、肺、肾等脏器并未发现明显病变,而在这个过程中也并未出现肉芽肿组织,但我们对细胞因子IL-2、IL-6、INF-γ和TNF-α的检测方面发现突变组能引起更强烈的IL-6、INF-γ和TNF-α的表达,这代表缺失株BCG?Wag22能引起机体更强的免疫反应。


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