西瓜低温响应MYB（Cla007586）转录因子的功能鉴定及互作蛋白分析

【摘要】：西瓜(Citrullus lanatus)是世界范围内广泛栽培和食用的园艺作物,具有很高的经济价值。低温是常见的环境胁迫因子,严重制约农业生产。西瓜属于喜温性作物,在早春和反季节设施栽培过程中,常常受到低温胁迫,影响产量和经济效益。研究西瓜低温响应基因的功能及调控网络,不仅可以解析西瓜的低温耐受性机制,也能为西瓜耐低温品种的遗传改良提供理论依据,具有重要的理论意义和现实意义。模式植物上的研究表明,MYB转录因子在植物响应低温及抵御低温过程中发挥着重要的调控作用。本课题在前期研究中,从低温胁迫下西瓜转录组数据中发现了一个显著上调表达的基因Cla007586,经鉴定为一个典型的R2R3型MYB转录因子。该MYB转录因子是否具有调控西瓜低温耐受性的功能及其是如何调控的,目前尚不清楚。为回答以上问题,本研究克隆了该基因,构建了过表达载体对烟草进行了遗传转化,分析了过表达烟草植株在低温胁迫下的表型和生理生化指标的变化,同时,通过酵母双杂交系统筛选出了其在西瓜中的潜在互作蛋白。主要研究结果如下:1.序列分析表明,Cla007586基因是一个典型的R2R3型MYB转录因子,开放阅读框长861 bp,编码286个氨基酸的多肽,预测分子量和等电点分别为32.6 kDa和5.79。低温胁迫下的转录组数据和实时荧光定量PCR分析表明,Cla007586基因受低温胁迫诱导显著上调表达。2.蛋白亚细胞定位表明Cla007586位于细胞核中。构建了pK7FWG2-Cla007586植物表达载体并在本氏烟草瞬时表达,通过激光共聚焦观察烟草叶片表皮细胞发现,绿色荧光仅位于细胞核中,且与细胞核染料DAPI的荧光重合。3.烟草转基因植株的获得。构建了pHellsgate8-Cla007586植物过表达载体,利用农杆菌LBA4404介导的叶盘法转化栽培烟草(Nicotiana tabacum L.cv.SR1)获得了转基因烟草植株,通过PCR和RT-PCR检测,筛选了OE3和OE5过表达烟草株系,并收获了T1代种子。4.过表达Cla007586基因降低了烟草植株的低温抗性。正常培养条件下,转基因植株与野生型烟草植株的生长及表型无明显差别。4℃低温胁迫处理后,与野生型烟草植株相比,转基因型烟草植株叶片表现出更为严重的失水萎蔫现象,且细胞膜损伤程度、膜脂过氧化程度均高于野生型烟草植株。5.Cla007586互作蛋白的筛选。构建了西瓜低温胁迫下叶片均一化cDNA文库于Y187菌株,同时构建了诱饵载体pGBKT7-Cla007586并转化Y2HGold菌株,在确保无自激活性和对酵母菌株生长无毒性的前提下,将两种酵母菌株混合培养,通过接合生殖,初步筛选出13个与Cla007586互作的蛋白。随后从中选择2个(A02和A10)已报道的与温度胁迫相关的蛋白进行了重点分析。A02编码ω-3脂肪酸去饱和酶,在模式植物中的研究表明它能催化二烯脂肪酸转化为三烯脂肪酸,改变膜内不饱和脂肪酸含量提高植物的低温抗性。A10编码热激转录因子,与温度胁迫密切相关。转录组分析表明这2个基因在西瓜低温胁迫早期都被诱导上调表达,猜测其可能与Cla007586互作调控下游基因表达实现对低温胁迫的响应。