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基于在线敲出技术和RTCA分析的龙眼核多酚关键抗氧化功能因子的快速筛选与活性评价

陈金玉  
【摘要】:龙眼核中含有大量的活性多酚化合物,在龙眼加工过程中,约占龙眼果鲜重17%的龙眼核被废弃,造成严重的资源浪费。因此,高效利用龙眼核中的多酚类物质是促进龙眼高值化综合利用的有效途径。但是目前龙眼核多酚中具有强抗氧化作用的关键成分尚不明确,本课题以此为切入点,通过功能组分的在线敲出技术,结合体外化学评价方法,快速筛选出龙眼核中的抗氧化关键成分。采用高效液相色谱-电喷雾-质谱(HPLC-ESI-MS)、傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR-MS)和核磁共振(NMR)等方法对筛选出的抗氧化功能组分中的酚类化合物进行了结构鉴定,并在不同的体外化学和细胞模型中进一步确证了在线筛选方法的可行性。利用微量量热法和实时细胞阻抗分析法比较了龙眼核抗氧化关键成分和12种代表性酚类化合物对H2O2诱导的小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3氧化损伤的保护作用,首次建立了基于细胞微电子阻抗技术的抗氧化活性成分快速筛选方法。主要研究结果如下:1.龙眼核多酚的提取及纯化采用正交设计试验优化龙眼核多酚的提取条件。在单因素试验的基础上,以乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度为自变量,以龙眼核多酚得率为考察指标,经过四因素三水平正交试验得出龙眼核多酚提取的最佳工艺条件:乙醇体积分数40%、料液比1:20(g/m L)、提取温度70℃、提取时间90min。通过对4种大孔树脂静态吸附及动态解吸性能的比较,确定D3520型树脂为龙眼核多酚分离纯化的理想树脂,洗脱剂乙醇体积分数为40%时,树脂对多酚的解吸率最高。2.龙眼核抗氧化关键成分的在线筛选采用HPLC在线敲出技术,结合FT-ICR-MS和测定还原能力、清除DPPH自由基能力以及氧自由基吸收能力(ORAC)等体外化学评价方法,筛选出龙眼核中对总抗氧化能力贡献最大的功能组分2-2及抗氧化功能因子峰4和峰6,而龙眼核多酚的主要成分没食子酸、以及抗氧化功能组分2-2中的(S)-flavogallonic acid、柯里拉京和没食子酸乙酯对龙眼核总抗氧化活性的贡献率则较低。利用HPLC-ESI-MS对抗氧化功能因子峰4和峰6进行了初步结构分析,结果表明,抗氧化功能因子峰4的结构是未知的,峰6可能为鞣花酸的衍生物。3.龙眼核抗氧化关键成分的结构鉴定及活性确证采用1h-nmr、13c-nmr、二维异核碳氢相关谱(hmbc)等结构分析手段对在线筛选出的龙眼核抗氧化功能组分的未知结构进行了解析,首次从龙眼核中鉴定出三种酚类化合物,分别是9-o-(3-羧甲基-4-对甲酰苯乙烯基)羟丁酸(化合物2),2-羟基-3-甲氧基咖啡酸-5-o-β-d-吡喃葡萄糖苷(化合物4),3′-o-甲基-4′-o-(4-o-没食子酰基-α-l-吡喃鼠李糖基)鞣花酸(化合物6)。采用水相体系和脂相体系(总抗氧化能力、orac、抑制β-胡萝卜素褪色、抑制黄嘌呤氧化酶活性)证实了新鉴定的化合物4和6的抗氧化能力最强,对总酚抗氧化活性的贡献最大。选用nih-3t3细胞模型进一步确证龙眼核关键成分在细胞生理水平的抗氧化活性,结果表明,相较于在体外化学体系中活性较弱的3′-o-甲基鞣花酸-4′-o-β-d-吡喃葡萄糖苷(p7)和没食子酸乙酯(p8),抗氧化功能因子2-羟基-3-甲氧基咖啡酸-5-o-β-d-吡喃葡萄糖苷(p4),3′-o-甲基-4′-o-(4-o-没食子酰基-α-l-吡喃鼠李糖基)鞣花酸(p6)在细胞体系中表现出更强的抗氧化作用,可以有效提高nih-3t3细胞抗氧化防御酶sod、cat、gsh-px的活性,降低h2o2诱导的过量活性氧(ros)水平,缓解线粒体和dna损伤,抑制细胞凋亡,保护细胞免于受到氧化应激的影响。龙眼核抗氧化功能因子在细胞体系的活性与基于体外化学评价的活性相关良好,充分证明了前期在线筛选方法的可行性。4.微量量热法用于多酚类抗氧化活性筛选的初探为找寻能在细胞生理水平快速、高效筛选抗氧化功效成分的方法,采用微量量热法探讨了四种龙眼核多酚,2-羟基-3-甲氧基咖啡酸-5-o-β-d-吡喃葡萄糖苷(p4),3′-o-甲基-4′-o-(4-o-没食子酰基-α-l-吡喃鼠李糖基)鞣花酸(p6),3′-o-甲基鞣花酸-4′-o-β-d-吡喃葡萄糖苷(p7)和没食子酸乙酯(p8),对h2o2诱导的nih-3t3细胞氧化损伤的影响。实验从热化学角度证实了龙眼核抗氧化功能因子p4和p6对细胞损伤具有更好的抗氧化修复作用。但是通过关联生物热检测和传统细胞检测的结果,发现二者的相关性并不高,推测生物热动力学体系可能并不能准确客观地反映酚类化合物的抗氧化功效。采用12种具有代表性的已知酚类化合物验证生物热模型的可行性,结果表明,由生物热动力学方法得到的化合物的抗氧化活性与前期基于体外化学实验得到的结果存在差异,提示因酚类加入而引起的细胞代谢产热的变化并不能准确反映酚类化合物的抗氧化活性,因此生物热模型并不适用于抗氧化活性成分的快速筛选及评价。5.建立基于细胞微电子阻抗技术的抗氧化活性成分的快速筛选方法采用基于微电子阻抗技术的实时细胞分析(RTCA)探讨了四种龙眼核多酚(P4、P6、P7、P8)对H2O2诱导的NIH-3T3细胞氧化损伤的保护作用。实验从电化学角度证实了龙眼核抗氧化功能因子P4和P6对细胞损伤具有更好的抗氧化修复效果。通过关联RTCA和传统细胞检测的结果,发现二者高度相关,推测基于细胞响应的微电子阻抗变化可以准确反映酚类化合物对NIH-3T3细胞损伤的抗氧化修复作用。采用12种具有代表性的已知多酚类化合物验证RTCA模型的可行性和适用性,结果表明,由RTCA体系得到的化合物的抗氧化活性与前期基于体外化学实验得到的结果完全一致,说明RTCA体系的电子阻抗变化可以准确反映化合物的抗氧化功效,因此RTCA模型适用于抗氧化活性成分在细胞生理水平的快速筛选和准确评价。


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