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GABA支路调控柑橘果实柠檬酸代谢的机理研究

盛玲  
【摘要】:有机酸是柑橘果实风味品质的重要组成成分,其含量高低与果实衰老进程和鲜果货架期长短紧密相关。柠檬酸是柑橘果实中最重要的有机酸,在柑橘采后贮藏过程中,有机酸会随着呼吸和能量代谢逐渐被消耗,导致果实风味品质下降,失去商品价值。不同果实中有机酸含量的高低受遗传、环境和栽培技术等因素共同影响;细胞内有机酸水平受其合成、分解、转运和液泡贮藏综合调控。前人关于有机酸代谢的研究大多集中在TCA循环关键酶的调控。近年来越来越多的研究者开始关注有机酸降解和液泡贮藏对其含量的影响。γ-氨基丁酸(GABA)支路是柠檬酸降解的主要途径之一,同时GABA代谢的最终产物琥珀酸又能回补到TCA循环,为该循环提供所需的碳骨架。因而细胞质中合成的GABA能否进入线粒体进一步代谢不仅影响柠檬酸的降解,同时还可影响TCA循环的底物供应。线粒体GABA透性酶(GABP)控制着GABA向线粒体的转运,是连接GABA代谢和TCA循环的阀门,但有关其对柠檬酸代谢的具体调控机制尚不清楚,以及其对GABA的转运引起的线粒体内外具体的生理生化反应也缺乏系统的研究。本研究以不同来源的高酸和低酸柑橘果实为材料,研究GABA代谢支路对贮藏期柠檬酸含量的影响,并以柑橘GABP为切入点,对其调控柠檬酸代谢的机制展开深入研究,主要结果如下:1.外源GABA处理可以显著提高采后贮藏期间夏橙(Citrus sinensis Osbeck‘Valencia’)和纽荷尔(Citrus sinensis Osbeck‘Newhall’)果实中柠檬酸的含量。实验结果表明,外源GABA处理柑橘果实,可诱导内源GABA积累。基因表达分析显示,处理可抑制GABA上游谷氨酸脱羧酶(GAD)的表达,同时在贮藏初期还降低了GABP的表达,从而抑制柠檬酸的降解。此外,与柠檬酸代谢相关的氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、缬氨酸以及脯氨酸在处理的果实中也出现不同程度的积累。GABA处理提高了果实中抗氧化酶如POD的酶活性和ATP的含量;同时显著降低了贮藏期果实的腐烂率,提高了果实的贮藏性能。与处理夏橙不同的是,GABA处理加速了纽荷尔果实果皮颜色由黄转红,提高了果实的贮藏品质。GABA作为GRAS(Generally Recognized As Safe)类化合物,本研究为柑橘采后生产提供了一种高效且安全的采后处理方法,用以提高果实的贮藏品质和性能。2.GABA支路基因的表达活性参与决定HB(Citrus grandis Osbeck‘Hirado Buntan’)×Fairchild(Citrus reticulata×Citrus grandis‘Fairchild’)杂交群体高酸和低酸果实中的酸水平。通过连续三年对杂交群体果实进行品质分析,发现可滴定酸(TA)含量稳定地表现出高于亲本的特征。选取杂交群体中稳定表现出最高酸和最低酸的果实进行贮藏实验。结果表明,在贮藏过程中TA含量下降明显,而可溶性固形物(TSS)含量变化不大。高酸果实中即使TA含量逐渐下降,却仍能维持显著高于低酸果实的特征。初生代谢物含量检测发现杂交群体TA含量的超亲特征主要归因于柠檬酸水平,而与苹果酸无关;除了天冬氨酸和天冬酰胺之外,与柠檬酸代谢密切相关的其他氨基酸没有表现出和柠檬酸含量类似的变化特征。值得注意的是,即使这些代谢物的含量在果实贮藏过程中会出现波动变化,却不改变其在高酸和低酸果实中的相对高低,说明果实发育成熟过程中积累的代谢物含量水平决定了其在贮藏过程中的含量高低。柠檬酸代谢相关基因的表达分析表明大部分GABA代谢支路基因以及顺乌头酸酶(Aco)的表达在高酸果实中显著低于低酸果实,是高酸果实维持高酸含量的主要原因。对果实的呼吸测定分析发现高酸果实的呼吸速率比低酸果实低,说明高酸果实中通过呼吸消耗的有机酸少。果实失水率测定结果表明在贮藏过程中失水率呈现逐渐上升的趋势,并且与TA含量呈现显著负相关关系,即高酸果实的失水率比低酸果实低,说明有机酸与水分之间存在密切联系。本研究从遗传背景对贮藏柑橘果实有机酸含量的影响着手,突出了GABA代谢支路活性对酸积累的决定作用。3.柑橘GABA转运蛋白基因(CgGABP)通过调控柠檬酸代谢相关基因的表达参与调控柠檬酸代谢,且转录因子Cgb HLH13和CgBBX32能够通过负调控GABP的表达参与调控柠檬酸水平。以柠檬酸含量差异较大的普通高酸柑橘品种HB柚(Citrus grandis Osbeck‘Hirado Buntan’)和低酸品种无酸柚(Citrus grandis Osbeck)为材料,同样发现在高酸HB柚果实中GABA代谢支路所有基因的表达都显著低于无酸柚,说明GABA代谢支路基因同样参与决定HB柚和无酸柚果实中的酸水平。因而以CgGABP基因为切入点对其进行了功能分析及对柠檬酸代谢的调控研究。聚类分析表明CgGABP蛋白属于氨基酸/多胺/有机阳离子(APC)超家族中双向作用的氨基酸转运蛋白(BAT)亚家族成员;拓扑结构分析表明CgGABP与已报道的AtGABP的结构非常相似,拥有12个跨膜结构域,并有很多保守的氨基酸残基。亚细胞定位结果显示CgGABP定位在线粒体中,属于线粒体GABA转运蛋白。将CgGABP超量表达转化番茄,成功获得转基因番茄植株。初生代谢产物分析发现,转基因番茄果实中柠檬酸含量明显增加。并且转基因番茄果实表现出高含量的谷氨酸、谷氨酰胺、棕榈酸和硬脂酸,以及低含量的脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、琥珀酸及蔗糖。进一步对柠檬酸代谢相关基因的表达分析显示超量表达CgGABP可以抑制番茄内源SlAco3a和SlAco3b的表达,诱导柠檬酸合酶(SlCS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(SlPEPC)基因的表达,因而促进了柠檬酸的积累。酵母单杂交文库筛选获得与CgGABP启动子互作的上游调控因子,并对其蛋白结构进行生物信息学分析,发现其中一个为bHLH家族成员,命名为CgbHLH13;另一个为BBX家族成员,命名为CgBBX32。亚细胞定位实验进一步确定转录因子CgbHLH13和CgBBX32定位于细胞核中,符合转录因子定位特征。酵母点对点实验进一步证实了转录因子CgbHLH13和CgBBX32与CgGABP启动子存在互作。烟草双荧光素酶分析发现转录因子CgbHLH13和CgBBX32负调控CgGABP的表达。超量表达转录因子CgbHLH13和CgBBX32转化柑橘愈伤组织,得到2个基因的转基因愈伤系。转录水平分析表明超量表达愈伤组织中GABP的表达显著低于野生型,符合负调控特征。同时柠檬酸含量在转基因愈伤中显著低于野生型,并且脯氨酸、鸟氨酸、GABA、丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸以及蔗糖含量在转基因愈伤组织中显著高于野生型,而谷氨酸、棕榈酸和硬脂酸的含量显著低于野生型,这些结果正好与超量表达CgGABP转基因番茄获得的结果相反,符合GABP被抑制的表型。另外转基因愈伤组织中Aco的上调表达及PEPC和CS的下调表达同样能够解释柠檬酸积累的下降。此外,超量表达CgGABP激活了GABA代谢支路,而谷氨酸分解代谢主要转向GABA代谢;相反,超量表达转录抑制子阻滞了GABA代谢,谷氨酸代谢主要向脯氨酸、鸟氨酸等其他路径进行分解代谢。本研究中,通过超量表达CgGABP基因以及超量表达CgGABP负调控因子抑制GABP表达的方法,充分证实了GABP基因对柠檬酸代谢的调控作用,且中心C/N的重排参与了GABP调控的柠檬酸积累过程;并第一次从上游调控的角度研究有机酸代谢,证实了转录因子CgbHLH13和CgBBX32通过负调控GABP的方式参与柠檬酸代谢。这些结果为调控柑橘果实有机酸代谢及其含量提供了新的思路。


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