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芸薹根肿菌近红外光谱检测体系及喜树碱抑菌机理的研究

董乔琳  
【摘要】:十字花科作物根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woronin)侵染引起的一种重要土传病害。该病害在全世界不同国家广泛分布,严重威胁十字花科作物产量和产品质量。由于根肿菌休眠孢子具有较强的生命力,在土壤中可以存活15年之久,一旦发病难以根治。因此,根肿病的早期检测对防控该病十分重要。为此,本研究在采用常规方法与分子生物学方法检测根肿病菌的基础上,探索了利用近红外光谱根肿病菌的技术体系,旨在将这一新技术用于根肿菌的检测。同时,本论文结合相关工作基础,研究了生物抗菌剂喜树碱(Camptothecin,CPT)对水稻褐条菌的抑菌机理。研究取得了如下主要结果:1.分别从湖北省长阳县发病田间采集大白菜根肿标样,在温室内人工接种“凱选优”上海青不同时间段幼苗,从标样中分离提取的病菌休眠孢子,制备成孢子悬浮液,经不同方法处理,进行显微镜观察。结果显示,在光学显微镜下可清晰观察到根组织内休眠孢子的形态(近圆形)、大小(2μm~3μm)。不同发育阶段感病幼苗的根毛中根肿菌出现不同形态,包括初级游动孢子(2 d苗)、初级原生质团(2 d~4 d苗)和游动孢子囊(8 d幼苗))和游离的休眠孢子。这种方法简便、快速、经济,对根肿菌侵染寄主的早期检测较为适用。2.通过对比分析不同DNA提取方法(CTAB提取法和醋酸钾提取法),以及对常规PCR方法的反应条件和引物进行筛选,进一步对常规PCR检测根肿菌方法进行了优化,筛选出可检测最低模板DNA浓度为10-4 ng/μL的根肿菌PCR检测方法。采用该方法对不同地区的4种十字花科作物品种、室内菌土接种的12种十字花科作物幼苗及土壤中含根肿菌的进行PCR检测,证明该方法检测效果良好。3.分别以早期油菜幼苗的根(叶)部组织为试验对象,探索了基于近红外光谱分析的新型根肿菌侵染分析与检测方法。基于导光谱和主成分分析等技术对近红外光谱数据进行分析,发现在1阶导和2阶导光谱的主成分特征空间中包含着鉴别根肿菌侵染的有效信息。并采用支持向量机对这些有效信息进行检测分析,在根组织的近红外光谱特征和多维特征中,当Sigma取0.4值时,0阶和2阶导光谱组合检测率最高,可达99.71%;而在叶组织的近红外光谱特征上,当Sigma取3.5~4.0值时,0阶和1阶导光谱组合检测率最高,可达99.28%。上述研究结果为十字花科作物根肿菌的早期监测、病原学深入研究和病害早期防控有应用价值。4.研究了喜树碱(CPT)对水稻褐条菌Aaa RS-2菌株的抑菌活性。发现浓度为0.5 mg/mL的CPT(pH 7.5,8 h)对Aaa RS-2菌株具有明显的抑菌作用,抑制率最高可达73.9%。通过游动性试验、活/死细胞染色、扫描电镜观察、血清学试验、分泌系统和拓扑异构酶相关基因差异性表达分析试验,进一步验证了CPT对该菌株的抑菌作用。差异性表达分析试验结果显示拓扑酶相关基因gyrB和分泌相关基因porin呈明显的差异表达。这些结果对揭示CPT对Aaa RS-2的抑菌机理提供了新的信息。上述结果扩展了CPT的抑菌谱,为利用这一生物杀菌剂防治水稻褐条菌提供了理论依据。


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