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松褐天牛气味结合蛋白及化学感受蛋白的功能分析

黄晓峰  
【摘要】:松褐天牛Monochamus alternatus Hope不仅以其自身钻蛀、啃食松树,造成树势衰弱枯死,更重要的是它能够传播松材线虫病Bursaphelenchus xylophilus,是松树的重要害虫。目前已经明确,嗅觉在松褐天牛寻找寄主植物、配偶、产卵场所等行为过程中起着重要的作用,但对于其嗅觉感受的分子机制并不清楚。研究表明,一类水溶性的小分子结合蛋白——气味结合蛋白(OBPs)及化学感受蛋白(CSPs),在昆虫嗅觉识别的第一步扮演关键角色。我们课题组前期通过转录组测序,在松褐天牛中也鉴定出了多个OBPs和CSPs,但对于这些蛋白在松褐天牛嗅觉中的功能并不清晰。为此,以松褐天牛为对象,结合免疫组化、荧光竞争性结合、荧光猝灭、RNAi及行为学测定等手段,探讨了几个OBPs和CSPs在松褐天牛嗅觉中的功能,以期为设计基于OBPs或CSPs为靶标的新的防控技术奠定理论基础。主要研究如下:1.松褐天牛气味结合蛋白(MaltOBPs)在触角感器中的定位采用扫描电子显微镜技术观察了松褐天牛雌雄虫触角感器并明确了主要的感器类型;利用体外表达纯化的气味结合蛋白(MaltOBP9,MaltOBP10,MaltOBP19,MaltOBP24)免疫新西兰大白兔,收集血清分离提纯多克隆抗体(anti-MaltOBP9,anti-MaltOBP10,anti-MaltOBP19,anti-MaltOBP24),并由Western Blot检测抗体的特异性,最终选用特异性较好的抗体(anti-MaltOBP9,anti-MaltOBP10);免疫组化的结果表明,MaltOBP9与MaltOBP10主要分布于雌雄成虫触角的刺形感器、毛形感器、锥形感器以及耳形感器,MaltOBP9和MaltOBP10可能参与普通气味物质以及性信息素的识别过程。2.MaltOBPs基因在触角中的表达及RNA干扰效应利用荧光定量PCR技术对松褐天牛MaltOBPs基因在雌雄成虫触角中的表达进行了分析。结果表明,MaltOBPs基因表达量随羽化后日龄的变化大且无明显规律,但被检测的5个气味结合蛋白编码基因几乎都在第6-9 d相对高表达,因此我们选取羽化后第5 d的雌雄成虫进行了部分蛋白编码基因的RNA干扰试验。结果表明,注射所干扰基因的dsRNA后,该基因的表达量会在注射后的第3-4 d有所下降,但与对照相比,并无显著的差异。3.松褐天牛化学感受蛋白(MaltCSPs)的体外表达纯化及结合特性分析通过基因克隆和质粒重组,导入到大肠杆菌的pET30a-MaltCSP7与pET32b-MaltCSP8分别成功表达在菌液上清和沉淀,利用包涵体变复性和镍离子亲和层析成功获得了重组MaltCSP8的纯蛋白。荧光竞争结合分析表明,MaltCSP8与16种气味物质在中性条件下的结合力均高于酸性,且对(+)-柠檬烯氧化物、(+)-β-蒎烯、α-异松油烯、月桂烯表现出很强的结合能力(K_(4))10)。荧光猝灭分析表明,16种物质在中性条件下均对蛋白呈现静态猝灭效应;表观结合常数、结合位点数说明MaltCSP8主要在中性环境中与物质发生结合反应,且通过热力学参数推断他们之间的作用力主要为氢键作用和范德华力。4.松褐天牛雌雄成虫对气味物质的行为反应为验证与松褐天牛结合蛋白显示较强结合能力的物质对松褐天牛成虫是否具有引诱活性,利用Y-型嗅觉仪测定了松褐天牛对部分物质的行为选择反应。结果表明,1%浓度的(+)-α-蒎烯对松褐天牛雌成虫具有显著的吸引作用;1%浓度的α-异松油烯和月桂烯对松褐天牛雄成虫有明显的忌避作用。


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