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马铃薯晚疫病广谱抗性QTL dPI09c的精细定位及抗性基因克隆

蒋锐  
【摘要】:马铃薯(Solanum tuberosum L.)就消费而言是世界上第三大粮食作物,也是我国重要的农业经济作物,目前国家推进的马铃薯主食产品开发战略,对保障粮食安全和促进饮食健康具有重要意义。由致病疫霉(Phytophthora infestans(Mont.)de Bary)引起的晚疫病给马铃薯的生产造成了毁灭性灾害,目前过量的施用化学农药既增加了生产成本,也对生态环境产生了严重影响,更重要的是并没有有效遏制病害的发生与蔓延。因此,选育对晚疫病具有广谱和持久抗性的品种,是马铃薯育种迫切需要解决的问题。然而,晚疫病的持久抗性机理尚不清楚,以至于一个多世纪以来国内外晚疫病抗病育种进展有限。马铃薯中具有NB-LRR结构域的主效抗性基因抗性持续时间较为短暂,目前认为马铃薯对晚疫病的田间抗性更持久、更广谱,因此选育具有田间抗性的材料成为了育种工作者的另一个选择。本实验室前期与国际马铃薯中心(the International Potato Center)合作,构建了一个具有广谱田间抗性的二倍体马铃薯群体B3C1HP100,并在9号染色体末端初步定位到一个主效QTL d PI09c。本研究在前期已有的研究基础之上,通过图位克隆、d Ren Seq、等位基因挖掘的方法精细定位并克隆了控制这个晚疫病广谱抗性主效QTL位点的基因R8,进而通过比较基因组的方法,揭示了该位点可能存在的进化机制。本研究的主要结果如下:1.离体叶片的抗性评价及晚疫病病原菌筛选。利用6个来源和毒力不同的晚疫病菌株,随机对原始定位群体B3C1HP100的部分单株进行离体叶片接种,结果显示3个中等毒力的菌株88069、HB16-1和Ljx18接种后,抗性后代表现为完全抗病,感病后代表现为感病;3个强毒力菌株UK3928a、HB14-2和EC-1接种后,抗性后代单株的抗病程度出现变化,但均为抗病等级,而感病后代仍表现感病。这些结果进一步证实B3C1HP100群体对不同的病原菌具有广谱抗性,菌株88069被选择用于后期试验。2.d PI09c区间标记开发与加密。根据初定位结果,利用651对引物(包括已报道的马铃薯9号染色体末端的304对基因标记引物及本研究针对初定位标记At3g24160f2(58.72 Mb)到染色体末端(61.54 Mb)的基因组序列开发的347对基因标记引物)对抗、感亲本和群体后代的抗感池进行筛选,得到44对多态性引物,用于d PI09c区段加密。3.QTL d PI09c的精细定位。通过对原始群体B3C1HP100和本研究构建并筛选获得的重组子群体B3C1HP106/4000共206个单株的基因型鉴定,结合表型数据分析,筛选获得了3个重组单株,将d PI09c区间缩小到了参考基因组上389 kb范围。4.BAC文库的构建与筛选。利用B3C1HP100群体中的一个抗病后代304413.40构建了覆盖马铃薯基因组约10倍的BAC文库。利用本研究开发的位于d PI09c两端的标记3233-1,8384-1和8586-1,以及共分离标记jr38,5455-1,jr69和jr78-2,从BAC文库中筛选到覆盖d PI09c的7个阳性BAC克隆,对其中两个能够覆盖整个区段的克隆进行测序,结果显示d PI09c的物理距离为186 kb,与参考基因组389kb的距离相比,减少了200 kb距离。经序列预测,发现该区段有10个注释为番茄抗斑萎病病毒基因Sw-5b的预测基因,因此,对克隆控制d PI09c抗性的候选基因奠定了基础。5.d PI09c位点基因分析。根据BAC序列预测结果,d PI09c区间含有NB-LRR基因簇。因此,本研究分别构建了2个抗病池和2个感病池,两个抗病池分别为抗性母本301071.3以及由群体B3C1HP100中27个抗性个体组成的混合抗病池;感病池分别为感病父本703308以及由27个感病个体组成的混合感病池。利用新开发的R基因诊断技术d Ren Seq,在抗病池中获得了唯一的全长基因R8,说明R8可能参与了d PI09c对晚疫病的抗性。6.R8等位基因挖掘及功能验证。利用等位基因挖掘的方法在抗性母本301071.3和2个抗性后代304413.40及304413.74中验证了d PI09c的抗性是由晚疫病抗病基因R8所提供。同时,利用相同的方法,在B3C1群体以及国内的抗病材料中克隆到R8,说明R8基因在不同地域和不同马铃薯基因型中发挥着重要的抗病功能。另外,在马铃薯野生种S.demissum中发现了R8的同源基因R8-like,基因功能鉴定表明它与R8相同,也具有晚疫病抗性,并且能够与无毒基因Avr8识别产生HR反应。由于原始定位群体和许多现代品种中都有来自于S.demissum的抗性背景,推测R8可能来自于野生种S.demissum。7.d PI09c基因组比较分析。对5个茄科材料[DM1-3 516 R44(S.phureja)、Ma R8(1/2 S.demissum)、304413.40(B3C1HP100)、Heinz1706(S.lycopersicum)和S.pennellii]在d PI09c区间的序列进行了比对分析,表明茄科不同物种的基因组在该区段发生了染色体重排事件,但是R8及其同源蛋白的序列相对较为保守,暗示这些R8的同源蛋白可能起源于相同的祖先,但是在不同的物种中因受到不同的选择压而出现了d PI09c区域进化上的差别。8.R8特异效应子Avr8的特异性与识别位点。在15个不同的晚疫病菌菌株中均克隆获得了无毒基因Avr8,结果显示其广泛存在于不同的晚疫病菌株中且序列高度保守。氨基酸序列的短截实验证明,Avr8的C端效应子结构域是与R8识别的重要区域。亚细胞定位显示,Avr8可能在植物的细胞膜和细胞核上发挥作用。这些结果对进一步研究R8基因的持久和广谱抗性机制提供了有益的线索。


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