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细菌生物膜对天然及工程纳米颗粒的响应机制

欧阳凯  
【摘要】:土壤中超过90%的微生物以生物膜的形式存在。生物膜可通过形成的胞外聚合物使其获得竞争性优势,如加强生物膜内微生物之间群体感应效应、帮助细胞在表面定殖、减少污染物的细胞毒性等。工业生产释放进入土壤以及土壤中天然存在的纳米颗粒(NPs)由于表面活性强,在土壤生物膜的形成、结构调控和功能发挥等方面具有重要作用。然而,目前对土壤中生物膜和NPs间相互作用及其功能的了解还相当欠缺,特别是从分子水平上对这些作用过程和机理的认识非常肤浅。因此,本课题选取外源工程NPs氧化锌(ZnO)和土壤纳米矿物赤铁矿(hematite)与代表性土壤细菌-恶臭假单胞菌,运用化学方法、微生物及分子生物学技术和借助现代仪器分析手段如激光共聚焦显微镜(CLSM)、透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)、石英晶体微天平(QCM-D)、等温滴定微量热仪(ITC)、结构光照明超分辨显微镜(SIM)等,分析不同类型NPs与细菌相互作用的分子机理,探讨NPs对细菌生物膜形成、结构和功能的影响,明确生物膜中细胞对NPs响应的分子机制。主要研究结果如下:(1)阐明了表面结合态腐殖酸(HA)介导下的赤铁矿纳米颗粒对恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的细胞毒性机制。纯赤铁矿纳米颗粒能够显著抑制细菌的生长,其半致死浓度(24 h-LC_(50))为23.58 mg L~(-1),而表面结合HA后可以显著减轻赤铁矿的毒性,其复合体的最大LC_(50)达到4774.23 mg L~(-1),这一结果也在纳米颗粒对恶臭假单胞菌细胞活性相关基因的转录调控影响的实验结果中被证实。共沉淀实验和透射电子显微镜观察表明,表面结合态的HA阻碍了赤铁矿纳米颗粒对细菌细胞的粘附且限制了其发生内生化作用。与纯赤铁矿纳米颗粒相比,赤铁矿-腐殖酸复合体体系中胞内活性氧(ROS)的产生和氧化应激基因的表达受到显著抑制。减少粘附作用和抑制ROS的产生可能是HA减轻赤铁矿纳米颗粒毒性的主要原因。本研究还根据Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek(DLVO)理论模型评估了赤铁矿和细菌细胞膜之间的界面相互作用能,发现纳米颗粒与细菌细胞接触的机率越大则其细胞毒性越强,而纳米颗粒与细菌细胞膜间能垒越大则其对细菌的毒性越低。研究结果为更好地理解自然环境中细菌或细菌生物膜与矿物相互作用提供了有益的借鉴。(2)揭示了细菌生物膜在形成过程中对工程纳米颗粒-Zn O NPs的响应机制及纳米颗粒的浓度效应。在低浓度阈值(0.5-30 mg L~(-1))内的ZnO NPs能够显著促进细胞的生长和生物膜的形成,而高浓度的ZnO NPs(30 mg L~(-1))显著抑制生物膜形成。CLSM分析结果表明,细菌细胞能够在0.5 mg L~(-1)的ZnO NPs表面大量定殖并形成生物膜,而在250 mg L~(-1)的ZnO NPs表面的细胞定殖和形成的生物膜生物量比纯细菌对照体系中生物膜生物量低11倍。0.5 mg L~(-1)的ZnO NPs体系中所测得的生物膜基质中蛋白质和糖含量的显著增加进一步证实了ZnO NPs的低浓度刺激效应。各处理中细胞生长和生物膜形成的显著差异也在细胞氧化应激以及生物膜形成相关基因表达的实验中得到了验证。0.5 mg L~(-1)的ZnO NPs能够刺激恶臭假单胞菌群体感应基因、脂多糖生物合成基因和抗生素抗性基因的表达;而500 mg L~(-1)的ZnO NPs高浓度暴露诱导产生了基因毒性并使得恶臭假单胞菌的抗氧化基因表达显著上调。(3)考察了纳米颗粒(ZnO NPs)对细菌生物膜形貌和结构的影响。QCM-D结果显示,ZnO NPs暴露使得细菌生物膜厚度和粘弹性降低,粗糙度增加;且ZnO NPs能够加速成熟生物膜细胞发生解体。纳米颗粒作用后生物膜中细胞表面官能团浓度显著下降,细胞表面次级蛋白的结构也发生一定的变化。恶臭假单胞菌吸附在石英晶体表面后能够形成稳定的三维细胞集群结构,其生物膜内细胞呈紧密有序排列。而ZnO NPs显著抑制细胞向第三维度定向扩增,NPs表面附着的细胞分散且排列紊乱,很难形成完整的生物膜。


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